LudgerTag™ 2-AB（2-氨基苯甲酰胺）多糖标记试剂盒（货号：LT-KAB-A2）包含经胺化还原反应使染料结合在多糖未结合还原端基的试剂，使用2-氨基苯甲酰胺（2-AB）标记未结合多糖。
应用：用2-氨基苯甲酰胺（2-AB）标记未结合多糖
染料性质
分子量 136.15
荧光 λex（染料） = 320 nm, λem = 420 nm
结构
样品数：通常每套标记试剂较佳情况下可分析15个独立样品。
样品量：每个样品含25pmol到25nmol多糖。
适合检测的样品：带有未结合还原末端的纯化聚糖，都可以进行标记。
结构完整性：未发现唾液酸、岩藻糖、硫酸盐或磷酸盐的损失（<2摩尔百分比）。
标记效率：通常大于85%（取决于样品）。
标记选择性：本质上是化学计量标记。
储存：室温下暗处储存。远离热源、避光和防潮。所供试剂至少可稳定保存两年。
运输：该产品可在室温下运输。
处置：使用时涉及的玻璃或塑料器皿以及溶剂，应确保不含糖化酶及外源性碳水化合物。在所有样品处理时，使用无粉末手套，避免受到外源性碳水化合物的污染。标记试剂设计的所有步骤都必须在干燥环境下操作，并使用干燥的玻璃和塑料器皿。一旦打开试剂瓶，应立即使用。多余试剂根据当地安全规则丢弃。
安全：仅供研究用。不得用于人体或药用。请阅读安全数据表（SDS）了解所有相关化学品。标记试剂涉及的操作，都应配备使用适当的个人安全保护装置 - 眼镜、耐化学性手套（如 腈类手套），以及在实验室通风柜进行操作。
试剂盒组成
每个标记试剂盒包括1瓶以下试剂:
| Cat. | # Item | Quantity |
| LT-2AB-01 | 2-AB染料 (2-氨基苯甲酰胺) | 5 mg |
| LT-DMSO-01 | 二甲基亚砜 DMSO | 350 μl |
| LT-ACETIC-01 | 冰醋酸 | 500 μL |
| LT-CYANOB-01 | 氰基硼氢化钠(还原剂) | 6 mg |
所需的其他试剂和设备
- 加热模块、炉或相近功能的干热器（不能使用水浴），设定在65°C
- 旋转蒸发仪（例如Savant, Heto, 或其它）
- 反应小瓶 (e.g. 聚丙烯 微量离心瓶)
- 注：如果进行样品标记后洗涤（参见样品洗涤部分），则需要其它试剂。
标记操作时间线
LudgerTag 标记过程,加上可选样品标记后洗涤，通常需要4-5个小时：
| 过程 | 时间 | 总时间（小时） |
| 样品转移到反应瓶并干燥 | 30分钟 | 0.5 |
| 配置并加入标记试剂 | 15分钟 | 0.75 |
| 样品和试剂一起培养 | 3 小时 | 3.75 |
| 标记后洗涤 | 1小时 | 4.75 |
还原性胺化
标记反应涉及一个两步反应过程。 (见图1):
1.希夫碱生成
具有未结合还原末端的多糖，其末端在闭环（有环）和开环（无环）状态之间处于平衡状态。染料的伯胺对无环还原端基残基的羰基碳进行亲核进攻，形成部分稳定的席夫碱。
2. 希夫碱还原
希夫碱亚胺基通过化学还原生成稳定标记的多糖。
图1:通过还原性胺化反应，用2-氨基苯甲酰胺标记多糖
标记操作概述
LudgerTag 多糖标记试剂盒，用于荧光或发色标记带有为结合还原端基的多糖。在所中色谱和结构序列分析中，经标记的多糖既可以进行高灵敏度荧光检测，也可以进行紫外吸收监测，包括使用LudgerSep液相色谱柱的色谱分析和使用外切糖苷酶的序列分析（参见 参考1-5, 7)。
标记过程概述如下：
1 多糖准备
准备多糖样品，去除类似盐和洗涤剂等可能干扰标记过程的污染物。
2 多糖干燥
将样品置于反应小瓶中干燥。
3 标记试剂准备
将试剂盒中相关试剂混合制备新鲜的染料标记溶液。
4 将标记试剂加入多糖中
将小量的标记溶液加入每一份多糖样品中
5 培养
培养样品使标记反应进行下去。
6 标记后洗涤
培养完成后，如有必要（根据后续分析过程而定），直接进入洗涤流程以去除过量的标记试剂。.
7 经标记的多糖储存或者分析
经标记的多糖样品现在可以用于分析了。
样品准备
要进行标记的多糖样品，无论是纯化的或是多糖混合物，必须包含未结合的还原端基，颗粒状且不含无机盐，并溶于易挥发的溶剂体系中（建议是纯水）。
下列物质可能干扰标记反应，必须在进行LudgerTag™ 标记之前，事先从多糖样品中去除：
不挥发溶剂
不挥发盐，尤其是过渡金属离子
洗涤剂
染料和染色剂，例如考马斯蓝
不挥发盐，尤其是过渡金属离子
洗涤剂
染料和染色剂，例如考马斯蓝
Ludger提供了一系列LudgerClean™试剂盒，用于在Ludgertag™标记之前洗涤多糖样品。这些内容在LudgerClean多糖洗涤指南[参考6]中有详细说明。
标准样品制备概述如下：
1 多糖纯化
如有必要，从样品中按照多糖洗涤指南[参考6]中所述去除非碳水化合物污染物。
2 将样品转移至反应小瓶中
从典型糖蛋白中获得的多糖，样品量应在100个皮摩尔-50纳米摩尔的范围内。单一的纯多糖，即使仅有5皮摩尔的量，也可以被标记，并在之后高效液相色谱分析中检测出。适用的反应小瓶，包括小型聚丙烯微离心管和可用于PCR操作的试管。
3 样品干燥
理论上，应使用旋转蒸发器干燥样品。如果条件不允许，可以小心使用冷冻干燥（尤其要确保在小瓶的底部的样品，冻干成小而致密的物质）。 不要将样品置于高温（>28℃）或极端pH环境下，因为这样会导致唾液酸在酸催化下耗损（高温、强酸），或多糖还原端的异构反应（强碱）。
标记试剂准备
按如下过程制备新鲜标记试剂：
4 制备DMSO-醋酸混合液
150μl冰醋酸加入盛有DMSO的小瓶中，并用移液器抽吸混合。
冰醋酸和DMSO的货号分别为LT-ACETIC-01和 LT-DMSO-01。
小心敲击安瓿瓶以震落附着安瓿上半部的内容物，然后小心打开安瓿瓶。
如果DMSO冻成固体，在烘箱或加热快上在30-65℃之间缓慢加热小瓶（在启封前）。
5 加入染料
将100μl DMSO-醋酸混合液加入LudgerTag™ 2-AB (2-氨基苯甲酰胺) 染料小瓶中，混合直至染料全部溶解。
染料货号为LT-2AB-01。
6 加入还原剂
将溶解的染料加入盛有LudgerTag™ 氰基硼氢化钠 (还原剂) 的小瓶中，使用移液器抽吸混合直至还原剂全部溶解形成最终的标记试剂。
氰基硼氢化钠还原剂的货号是LT-CYANOB-01。
如果还原剂难以溶解，那么在65℃的恒温培养箱中，或者加热块上，轻缓地加热至多4分钟。如还原剂仍未全溶，补加10μl纯水并混合均匀。
标记试剂应防潮，并在配置60分钟内使用。
标记反应
7 将标记试剂加入样品
将5μl标记试剂加入到每一份经干燥的多糖样品中，盖上离心管，彻底混合，然后轻轻敲击以确保标记溶液位于小瓶的底部。
8 培养
将反应小瓶放在65℃的加热块、砂浴或烘箱中，培养3小时。
培养必须在干燥的环境下进行。请使用培养箱或干燥块，请务必不要使用水浴。
样品必须全部溶解在标记溶液中，才能有效进行标记。为了促进全部溶解，样品可在培养温度达到65℃后涡旋混合30分钟，然后继续培养。
在大多数情况下，培养时间可以缩短至2小时或延长至4小时，而不会显著改变标记反应结果。
9 离心并冷却
培养结束后取出样品，短暂离心微量试管，并让其全部冷却至室温。
LudgerClean™ S 标记后样品洗涤
对于特定的应用 - 例如后续的HPLC分析，标记后的样品洗涤(去除多余的染料和其它标记试剂) 是必不可少的。使用LudgerClean™ S 小柱 (货号 LC-S-Ax, 此处x代表试剂盒中小柱的数量)按试剂盒所附标准操作程序可以完成样品洗涤。
对于过量标记试剂不会影响后续样品分析的应用而言，样品标记后洗涤并非必需。这些分析手段包括碳水化合物电泳，游离染料会从标记多糖条带处分离开。
LudgerTag™ 2AA标记多糖的分析
LudgerTag™ 2-AB标记多糖可通过一系列分析方法进行研究，包括HPLC，凝胶电泳和质谱。 这些会在参考资料8里详细叙述，在下文也有概述。
高压液相色谱分析
LudgerTag™ 2-AB标记多糖混合物可以通过一系列HPLC（高压液相色谱）方法进行分离和分析，也包括LudgerSep HPLC:
|
分析类型 |
柱子 |
货号 |
|
带电荷和中性多糖的分离 |
LudgerSep™ C |
LS-C-01 |
|
带电荷和中性多糖的剖面分析 |
LudgerSep™ N |
LS-N-01 |
|
中性多糖的分离 |
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