LudgerTag DMB唾液酸释放和标记试剂盒（货号：LT-KDMB-A1）和包含试剂，用于从糖蛋白释放唾液酸，通过胺环化反应释放的唾液酸阿和DMB结合。
应用：用于从糖蛋白释放唾液酸，并用1，2-二氨基-4，5-亚甲氧基苯二盐酸盐（DMB）标记。
相对分子量 = 225.07 gmol-1
荧光 λex = 373 nm, λem = 448 nm.
结构
近义词 DMB; 1,2-Diamino-4,5-methylenedioxybenzene Dihydrochloride; 1,3-Benzodioxole-5,6-diamine Dihydrochloride; 5,6-Diamino-1,3-benzodioxole Dihydrochloride
描述：该试剂盒和包含试剂，用于从糖蛋白释放唾液酸，通过胺环化反应，经释放的唾液酸和DMB结合。
样品测试数：本试剂盒包含试剂和原料，可供多至22个样品检测用，包括唾液酸参照品、N-乙酰基神经氨酸和N-乙二醇神经氨酸定量标准品。
样品量：通常每次可以分析50-200μg糖蛋白。我们建议分析样品一式三份。
适合测试样品：从糖蛋白、糖肽或聚糖释放的唾液酸都可以标记。
储存： 保存在 -18°C暗处。避免热源，光照和潮湿。如妥善保存，试剂可以稳定至少2年。
运输：该产品可以在室温下运输。
处置： 使用时涉及的玻璃或塑料器皿以及溶剂，应确保不含糖化酶及外源性碳水化合物。在所有样品处理时，使用无粉末手套，避免受到外源性碳水化合物的污染。打开试剂瓶后，应立即使用。多余试剂根据当地安全规则丢弃。
安全：仅供研究用。不得用于人体或药用。请阅读安全数据表（SDS）了解所有涉及的化学品。进行标记试剂涉及的操作，都应使用适当的个人安全保护装置 - 眼镜、耐化学性手套（如 腈类手套），以及在实验室通风柜进行操作。
试剂盒组成
每个试剂盒包括以下试剂各1瓶：
| Cat. | # Item | Quantity |
| LT-DMB-01 | DMB染料 | 0.7 mg |
| LT-ACETIC2M-01 | 冰醋酸 2 Molar | 2 x 1.1 mL |
| LT-MERCAPTO-01 | 巯基乙醇醋酸溶液 (1.4 Molar) | 500 μL |
| LT-DITHIO-01 | 连二亚硫酸钠 (Reductant) | 4 mg |
| CM-NEUAC-01 | N-乙酰基神经氨酸定量标准品 | 1 nmol |
| CM-NEUGC-01 | N-乙二醇基神经氨酸定量标准品 | 1 nmol |
| CM–SRP-01 | 唾液酸参照品，包括 Neu5Ac, Neu5Gc, Neu5,7Ac2, Neu5Gc, 9Ac, Neu5, 8Ac2, Neu5,9Ac2 and Neu5,x,xAc3 (此处x表示未知乙酰基位置) | 1.25 nmol (总唾液酸) |
所需的其他试剂和设备
- 加热模块、炉或相近功能的干热器，设定在80°C用于唾液酸释放，设定在50°C用于唾液酸标记反应
- 量程在1-1000 μL的移液器和吸头
- 真空离心机
- 反应小瓶 (e.g. 0.5 mL聚丙烯瓶)
- 分析级水 (eg. MilliQ)
- 如需重复检测，额外的唾液酸标准品【可选】：CM-NEUAC-01; CM-NEUGC-01
-
阳性对照【推荐】：
标记操作的时间线
LudgerTag 标记过程, 加上干燥时间和从分析样品中酸解唾液酸，通常需要7个小时：
| 过程 | 时间 |
| 样品制备 | 20分钟?+ 干燥 (1-2 小时) *该操作可提前1天进行 |
| 唾液酸释放 | 3 小时 |
| DMB 标记 | 3.5 小时 |
| 总时间： | 加上干燥7小时 |
方法
1 样品制备
我们建议使用三等份试样进行分析。高度唾液酸化的糖蛋白，取样量50μg为宜；对于低唾液酸化样品，如IgG等，取样量提高至200μg。
请注意部分蛋白质常用的盐/缓冲液可能对唾液酸分析产生干扰。这取决于样品取样量与缓冲液体积的比例(大量缓冲液会影响酸性水解时溶液的酸性)。根据我们的经验，类似PBS等缓冲液，在样品浓度高于1mg/mL,样品取样量在50-200 μg 之间，不会产生问题。
我们建议在样品分析过程时，使用一系列的控制标品：
将等量的样品和过程控制标品（除非已经干燥）置于0.5 mL聚丙烯小瓶中, 在真空离心机中干燥。
2 唾液酸释放
设定炉温80°C
往样品和过程控制样小品中加入25 μL 2 M冰醋酸溶液。
以下唾液酸标样中不要加: 如使用Neu5Ac (CM-NEUAC-01), Neu5Gc (CM-NEUGC-01), Sialic acid 参照品 (CM-SRP-01) 小瓶 或 Neu5,9Ac2 (CM-NEU5,9,AC-01)。
旋涡溶解，然后短暂离心。
将样品和对照品置于80°C的烘箱中，培养2小时（±5分钟）。从烤箱中取出，冷却至室温。旋涡，然后短暂的离心。
从每个样品或过程控制转移5微升到0.5毫升的聚丙烯小瓶中，准备用DMB标记。如需要，经酸释放的样品可在-20°C下储存至少2天[参考1]。
3 DMB标记
设定炉温50°C.
添加440 μL巯基乙醇溶液（LT-MERCAPTO-01）到盛有连二亚硫酸钠（LT-DITHIO-01）的小瓶中，使用移液器反复抽吸混合直至固体完全溶解。
将上述溶液完全转移到盛有DMB 染料 （LT-DMB-01）的小瓶中，使用移液器反复抽吸混合直至染料完全溶解。
为保护标记试剂不受湿气和曝光的影响，应在60分钟内使用。 将20 μL标记试剂加入每个样品和过程控制样中，盖盖，涡旋彻底混合并短暂离心，确保标记溶液位于瓶底部。
? 将20 μL标记试剂加入每个唾液酸标样中(Neu5Ac, Neu5Gc, 唾液酸参照品, 加上 Neu5,9Ac2 ，如需), 盖盖，涡旋彻底混合并短暂离心，确保标记溶液位于瓶底部。
将样品、控制样和标准品置于50°C 炉中暗处培养3小时
在培养时，你可以着手调整LC的检测条件用于接下来的分析 – 参见第4部分.
从炉中取出小瓶，加入以下试剂终止反应：
往每个样品和控制样中加入475 μL水
往每个唾液酸标准样中加入480 μL水
4 LC分析
稀释Neu5Ac和Neu5Gc标准品用于标准曲线制作 (使用表1作为指导, 通常Neu5Gc含量比Neu5Ac要低一些, Neu5Gc曲线范围较Neu5Ac的要低一阶)。混合均匀。
该项操作可以在液相色谱柱调节时进行。
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Neu5Ac Std (μL)
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Water (μL)
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1 in 1
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200
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0
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1 in 2
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100
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100
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1 in 5
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40
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160
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1 in 10
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20
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180
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1 in 50
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10
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490
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1 in 100
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10
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990
|
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1 in 1000
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20 from 1 in 100 (premixed)
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180
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1 in 5000
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-
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-
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Neu5Gc Std (μL)
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Water(μL)
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-
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-
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100
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100
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40
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160
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20
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180
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10
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490
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|
10
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990
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20 from 1 in 100 (premixed)
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180
|
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10 from 1 in 50 (premixed)
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990
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表1. 标准品稀释方案
将样品1加水从1份稀释到10份 (20 μL 样品加180 μL水)。
将过程控制标准品用水稀释10倍 (如使用Neu5,9Ac2，亦稀释)。
不要稀释 唾液酸参照品(SRP).
注：如果已知样品的唾液酸化水平较低（如IgG），则不要用水稀释。如果你发现液相色谱峰面积不在标准曲线范围内，那么要么配置更浓的样品，要么延长标准曲线。
样品在10°C下避光的自动进样器内可以至少保持稳定72小时【参考2】。
准备液相系统。应确保溶剂管路事先准备好。
溶剂 A = 乙腈:甲醇:水 9:7:84
溶剂 B = 乙腈
荧光: 激发波长: 373 nm; 发射波长: 448 nm
柱温 = 30°C; 进样温度 = 10°C
溶剂 B = 乙腈
荧光: 激发波长: 373 nm; 发射波长: 448 nm
柱温 = 30°C; 进样温度 = 10°C
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时间(分钟)
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流速?mL/min
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%A
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%B
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0
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0.5
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100
|
0
|
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19
|
0.5
|
100
|
0
|
|
19.5
|
0.5
|
10
|
90
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|
23.5
|
0.5
|
10
|
90
|
|
24
|
0.5
|
100
|
0
|
|
30
|
0.5
|
100
|
0
|
表 2. 使用LudgerSep-R1 柱(4.6 x 150 mm, 3 μm 颗粒) LS-R1-4.6x15030 进行30分钟HPLC分析的操作方法。
进样量 = 25 μL.
进样量 = 25 μL.
|
时间(分钟)
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流速?mL/min
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%A
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%B
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|
0
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0.25
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100
|
0
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|
7
|
0.25
|
100
|
0
|
|
7.5
|
0.25
|
10
|
90
|
|
8
|
0.25
|
10
|
90
|
|
8.5
|
0.25
|
100
|
0
|
|
15
|
0.25
|
100
|
0
|
表3. 使用LudgerSep-uR 柱(2.1 x 100 mm, 1.9 μm 颗粒) LS-UR2-2.1x100 进行15分钟UHPLC分析的操作方法。
进样量 = 5 μL.
进样量 = 5 μL.
使用适当的方法（按表2使用Ludgersep-R1柱进行高压液相色谱分析，或按表3使用Ludgersep-UR2柱进行超高压液相色谱分析）空进样2到3次调节色谱柱。然后进一个系统空白水样，检查基线是否稳定。如果没有，则继续进水样直到基线稳定，或在重新调整柱效前，使用10%A和90%B冲洗30分钟。
接下来进2次以上SRP唾液酸参照品，直到谱图重叠。 HPLC图谱应类似于图1，UHPLC图谱则与图2相近。不过，保留时间会因LC系统而异。
LC系统现在可以进行样本分析。我们建议按以下顺序进样（表4）：
SRP 唾液酸对照品
Neu5Gc 稀释液，用于绘制标准曲线
Neu5Ac 稀释液，用于绘制标准曲线
过程控制标准品 (胎球蛋白; GPEP; 水r; 缓冲液)
样品
Neu5Gc 稀释液，用于绘制标准曲线
Neu5Ac 稀释液，用于绘制标准曲线
SRP 唾液酸对照品
Neu5Gc 稀释液，用于绘制标准曲线
Neu5Ac 稀释液，用于绘制标准曲线
过程控制标准品 (胎球蛋白; GPEP; 水r; 缓冲液)
样品
Neu5Gc 稀释液，用于绘制标准曲线
Neu5Ac 稀释液，用于绘制标准曲线
SRP 唾液酸对照品
表 4.进样顺序
5 验收标准
SRP与样品组的图谱在开始和结束应重叠，且偏移量多在 ± 0.1 分钟。
对于Neu5Gc和Neu5Ac，校正曲线的R2值>0.99。
遵循企业内部标准操作规范，Ludger对于胎球蛋白分析验收标准为252 到377 nmol/mg 蛋白质 (例如 34 μg 胎球蛋白 50U酶活)
【参考3】。该验收标准随着更多GCP-FET-50U内部数据的收集，会进一步更新。在参考文献3列明了验收标准的历史数据，并附有详细的解释。
Ludger企业内部对于GPEP-A2G2S2分析验收标准为5.6 到 8.4 nmol (由定量NMR测定 ± 20%)
图 1: DMB标记唾液酸参照品(CM-SRP-01)在LudgerSep-R1 HPLC柱跑出的液相图谱。
峰: 1 = Neu5Gc; 2 = Neu5Ac; 3 = Neu5,7Ac2; 4 = Neu5Gc,9Ac; 5 = Neu5,8Ac2; 6 = Neu5,9Ac2; 7 = Neu5,x,xAc3 ( 此处x表示未知乙酰基位置); * = 试剂。
注:此图谱仅作为示例。峰宽、分辨率和保留率与实验室高效液相色谱系统有关。
注:此图谱仅作为示例。峰宽、分辨率和保留率与实验室高效液相色谱系统有关。
图 2: DMB标记唾液酸参照品在LudgerSep-uR2 UHPLC柱跑出的液相图谱。
峰: 1 = Neu5Gc; 2 = Neu5Ac; 3 = Neu5,7Ac2; 4 = Neu5Gc,9Ac; 5 = Neu5,8Ac2; 6 = Neu5,9Ac2; 7 = Neu5,x,xAc3 (此处x表示未知乙酰基位置); * = 试剂。
注:此图谱仅作为示例。峰宽、分辨率和保留率与实验室的超高效液相色谱UHPLC系统有关。
注:此图谱仅作为示例。峰宽、分辨率和保留率与实验室的超高效液相色谱UHPLC系统有关。
参考文献及相关文献
1. Ludger Document: S-GP-0048-WG-50381-Report-v1.0. Determination of the effect of freezing of DMB Labelled Sialic Acids.
2. Ludger Document: Fetuin Specifications for Sialic Acid Analysis-v2.0. Determination of Acceptance Criteria for Fetuin System Suitability Standard in Sialic Acid Analysis
3. Ludger Document: DMB-kit-Validation-Report-GP-0057-v1.0. Validation of the DMB kit with Ludger Standards.
4. Ludger Document: Application note on ‘Quantitative Sialic Acid Analysis’ #APN002
反应机理
标记反应是一个两步反应过程。
1.第一步是闭（环）形式唾液酸平衡到开环（非环）形式。
2.第二步系多步机制，其中DMB染料的伯胺与α-酮酸的羰基反应形成亚胺，该中间体与溶液中的还原剂反应，再与染料的其它伯胺反应。重排后生成带荧光标记的唾液酸（二亚胺）。
故障排除
1.HPLC信号低
酸解不完整: 酸解时，我们推荐使用烘箱替代加热元件。 部分加热元件会导致样品瓶中的酸蒸发和在瓶盖处凝结从而导致酸解不完整。我们同时推荐在酸解时使用小型样品瓶,体积不超过0.5 mL。
样品中的盐干扰标记：盐和缓冲液会干扰唾液酸标记法。 如果你怀疑盐对样品产生干扰，分析前将样品透析成无盐溶剂。
2. 色谱图中游离染料峰偏高
这可能是由于曝光过多导致的。请确认培养是在暗处避光操作的。一旦样品标记后，立即送检测HPLC以避免降解，样品曝露在光和热源时间增长会引起非唾液酸特征峰的增加。这也可能是由液相色谱长时间使用受污染导致，见下文。
在10度避光条件下，DMB标记的样品可保存72小时，因此Neu5Ac和 Neu5Gc的数量很稳定,
前提是校准在相同条件下储存并立即进行分析【参考文献3】。如果这个难以实现的话，DMB标记样品可以冷冻保存至多2天【参考文献1】。
3.液相色谱峰保留时间波动；基线不稳定。
不正确的或旧的液相溶剂。始终以相同的方式制备溶剂（例如，通过将两种溶剂混合在一起，使一种溶剂在量筒中达到一升，这与分别测量两种溶剂并在瓶子中混合不同）。等比例梯度对溶剂制备的变化特别敏感。由于蒸发，溶剂成分会随时间变化。
色谱柱被过量的游离染料/肽等污染，会导致保留时间偏移，谱图上出现额外的峰。对于低唾液酸化水平的样品来说，这个问题更大，因为大量的蛋白质被注射到色谱柱里。用常规洗脱溶剂和乙腈10:90的混合物，以正常流速清洗柱子。
超高效液相色谱系统的运行条件尚未优化。评估您是否使用UHPLC的一个常见变量是“强/弱清洗”。这些对色谱法有显著的影响。常规而言，“弱洗”使用弱的梯度条件，“强洗”使用强的梯度条件。您需要评估其中哪一种产生的SRP峰形与产品指南相一致。。我们建议开始线使用弱洗涤液进行液相色谱优化。
4.标记溶液中有析出
尽管非常罕见,在制备DMB标记溶液（连二亚硫酸钠、巯基乙醇和DMB混合物）仍有可能发生轻微的析出。我们曾观察到此类现象，并检测了该物质对标记效率的影响，并确定析出物不会影响标记反应。
5.唾液酸参照品 (SRP)在 (U)HPLC的图谱与说明书不一致。
请确认该参照品未用酸处理。如用酸处理，SRP图谱的仅包含Neu5Ac 和Neu5Gc相关的峰。
本产品仅供体外研究用。