用于定量检测PEG和PEG修饰性蛋白的ELISA试剂盒

应用：此试剂盒仅用于科研，不可用于诊断和治疗

背景：生物制剂PEG化后可通过减缓蛋白水解和从循环系统中清除的速率来延长半衰期。PEG化蛋白的药效学可通过蛋白自身的特异性分析来进行评估，但这些方法需要消耗大量时间，且建立目标蛋白的ELISA昂贵。西宝生物供应PEG ELISA试剂盒，可以检测PEG化蛋白的PEG段，因此可用于PEG化蛋白药效学的评估。

产品介绍：

分析试剂盒是直接竞争ELISA。共价结合甲氧基-PEG的BSA（牛血清白蛋白）包被在96孔微孔板上。稀释的样品和包含PEG化蛋白的标准品（50ul）加到微孔板中，结合抗-PEG的辣根过氧化物酶（HRP 抗-PEG,50ul）加到微孔板中，微孔板在微孔板振荡器上孵育1小时。冲洗微孔板，TMB，HRP底物（100ul）加入到孔中孵育20分钟，会产生蓝色。加入1N HCL（100ul）终止反应，颜色将由蓝色变为黄色，检测其在450nm处的吸光值。如果样品中含PEG，它就会与包被在板上的PEG竞争结合HRP 抗-PEG，吸光度值会减小。

ELISA试剂盒中使用的抗体是小鼠单克隆抗体，对聚乙二醇主链具有专一性。研究表明此试剂盒可用于检测包含1个或多个PEG链的蛋白和未结合的PEG。灵敏度会随着PEG链的长度增加和PEG化的程度而增大，因此我们可以产生一个标准曲线。试剂盒提供标准品是带20kDa mPEG链的BSA，用户可以用标准品去确认试剂盒的性能。

试剂盒中包含内容：
PEG包被的96孔微孔板（12个可拆开的条，每条有8个孔），在-20℃下储存
HRP抗-PEG复合物，20ul（1瓶），在-20℃下储存
HRP PEG稀释液，50ml
PEG-BSA标准品，20ul（1瓶），在-20℃下储存
HRP PEG清洗缓冲液（20×）,50ml
TMB试剂，11ml
终止液，11ml

需要准备的耗材如下：
精确的移液器和枪头
蒸馏水或去离子水
聚丙烯或玻璃管
混合仪
吸水纸或纸巾
微孔培养仪/混合器（混合速度～150转/分钟）
平板垫圈
450nm处光密度范围在0-4的平板阅读器
绘图软件

试剂盒标准液的制备

1. 标记8支聚丙烯管或玻璃管，浓度为1000,200,40,8,1.6,0.32,0.064和0ng/ml
2. 制备1000ng/ml的标准品，在PEG标准品标签上进行描述
3. 加入200ul的稀释液到管中，标记为200,40,8,1.6,0.32，0.064和0ng/ml
4. 吸取50ul的1000ng/ml PEG标准品到管子中，标记200ng/ml，并混合。此试剂盒提供200ng/ml PEG-BSA标准品。
5. 通过5倍连续稀释制备40,8,1.6,0.32和0.064ng/ml的标准品

分析过程

1. 保护支持板上合适数量的包被孔
2. 吸取50ul标准品和样品到孔中（建议标准品和样品分别一式三份）
3. 加入50ul的HRP 抗-PEG复合物到孔中
4. 在150转每分钟的微孔板振荡器上室温（25℃）孵育1小时
5. 使用一个平板垫圈，清洗孔6次，每孔加入400ul的清洗液
6. 在吸水纸或纸巾上急剧地敲击孔，去掉剩余的清洗液
7. 吸取100ul的TMB试剂到每个孔中
8. 在150转/分钟的微孔板振荡器上轻轻地混合20分钟
9. 加入100ul的终止液到每个孔中终止反应
10. 轻轻混合直到蓝色变为黄色
11. 5分钟内读取450nm处的吸收值

结果计算

1. 读取参考标准品和样品在450nm处的平均吸光值
2. 用平均吸光值和浓度的lg值做标准曲线，Y轴是吸光值，X轴是浓度
3. 将数据建立S形曲线模型。曲线的上线是浓度为0ng/ml处的吸光值，曲线的下线是浓度为1000ng/ml处的吸光值
4. 使用每个样品的平均吸光值来确定PEG化蛋白的Log10浓度值，然后计算出浓度值
5. 建议落在标准曲线内50%区域的吸光值来确定PEG的浓度。比如，吸光度值范围在0.1和1.6.那么样品的吸光度值应该在1.225和0.475的范围
6. 计算出浓度，然后乘以稀释因子来计算出血清或血浆样品中PEG化蛋白的实际浓度
7. 如果样品的吸光度值不在标准曲线范围内，样品需要重新稀释和检测

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