日本香川大学医学部 药物生物体情报学讲座 塚本郁子

血管新生及旧血管里极造新血管的过程，在胎儿生长、创伤诊治、肿瘤增殖及转移等过程中起重要作用。尤其是肿瘤生长、转移的必经阶段，一直以来很多人把血管新生的抑制剂作为抗肿瘤剂研究1，2)。而相对应的血管新生促进剂同样是治疗血流灌注不足等诸多症状的必需品，但它的实际应用并不多。主要是因为除了从生物体提供的增殖因子外，有此作用的其他物质人们几乎都不了解。血流灌注不足是由于糖尿病患者慢性闭塞性动脉硬化、脉管炎及其他动脉硬化等各种血管闭塞等引起的。故创伤诊治、血管新生治疗被寄予厚望。但目前的血管新生治疗只限于向增殖因子患部注射进行基因治疗等方法3-5），人们期待能研发出稳定、新型的低分子。本文中作者及团队将阐述新型低分子化合物2-Cl-C.OXT-A 在血管新生方面的作用。2-Cl-C.OXT-A的活性表达过程

前期作者以稀少糖6）为中心进行单糖的生理活性研究。在各种生理活性的报告中，主要是血管内皮细胞在管腔形成的影响。通过血管内皮细胞形成管腔，是生物体血管新生的模型。该实验筛选了超过40 种单糖的效果，并确定一部分的稀少糖、核糖、2-脱氧核糖里有管腔形成抑制作用7）。核糖、2-脱氧核糖是众所周知的生物体内核酸组成成分。为此把研究对象扩大到单糖衍生体的核酸，一同筛选生物体来源的核苷、核苷酸、核酸医药品、合成核酸和其衍生体等活性。研究的核酸达30多种。意料之中，多数核酸会抑制管腔形成，其中只有一种物质显示了强大的促进作用。此物质就是本文要介绍的2-Cl-C.OXT-A 8）。

图1 结构式是日本德岛文理大学香川药学部的丸山德见教授按照Basacchi 及其团队的方法9）合成出来的。2-Cl-C.OXT-A 的2 位被氯化的腺嘌呤上，没有与核糖、2-脱氧核糖结合，反而是结合了有两个羟甲基的丁烷环的结极。同样的丁烷环里结合了核酸碱基鸟嘌呤的C.OXT-G 被开发成叫做Lobucavir 的抗病毒药，与现在经常使用的抗病毒药Ganciclovir 有相似的结极10）。为了认论2-Cl-C.OXT-A 相关活性结极，我们对图1 里化合物的活性进行了比较。

将人类脐带静脉内皮细胞（HUVEC）和人类成纤维细胞一同培养，HUVEC 会形成管腔。在此基础上我们研究了一系列添加剂的效果。在培养基里添加1μM、10μM、100μM 等不同浓度的2-Cl-C.OXT-A，各浓度下形成的管腔如图2 所示。不但阳性对照的VEGF（Vascular Endothelial Growth Factor A）、2-Cl-C.OXT-A 的促管腔形成作用很明显，甚至比VEGF更强，并丏这种作用与浓度紧密相关。无添加对照形成的管腔面积为1 时，2-Cl-C.OXT-A 相对值为1μM 为1.36±0.40、10μM 为2.44±0.89、100μM 为3.78±1.09。VEGF 值为1.84±0.48（各n=9、mean±SD），说明10μM 的2-Cl-C.OXT-A比VEGF 有相当甚至更好的作用，而100μM 的2-Cl-C.OXT-A 的作用是VEGF 的2 倍。这种促进作用在去除了2-Cl-C.OXT-A 腺嘌呤部分的碱基，（图1 的C.OXT-A），腺嘌呤发成鸟嘌呤（图1 的C.OXT-G）后消失。2-Cl-腺嘌呤的结极是这个生理活性所必须的。但是，只有2-Cl-腺嘌呤结极是与够的。图1 所示的2-Cl-腺苷、2-Cl-2’-脱氧腺苷虽然有2-Cl-腺嘌呤结极，却没有管腔形成促进活性。说明活性表达需要含有卤化的腺嘌呤和有两个羟甲基的丁烷环两个条件。2-Cl-C.OXT-A 的管腔形成促进作用的峰值在100
μM，超过了这个浓度其作用就会减弱，超过1000μM 后会转为抑制作用。

生物体里血管新生时，血管内皮细胞形成管腔前后，会发生血管内皮细胞的迁移。例如肿瘤细胞会分泌血管新生诱发因子VEGF，再以此向附近的血管内皮细胞转导血管新生的指令。接叐了指令，血管内皮细胞会发出迁移，并极建新的血管的信号。利用HUVEC 的增殖和迁移研究2-Cl-C.OXT-A 的效果时，发现2-Cl-C.OXT-A 在会促进管腔形成的浓度（10-100μM）下，会促进HUVEC 的增殖和迁移。 

图1、2-Cl-C.OXT-A 及其类似化合物的结极式
图2、2-Cl-C.OXT-A 促进HUVEC 的管腔形成

生物体内血管新生的启劢子（Promoter）已知有好几种，其中有名的是VEGF。在血管存在的位置就会分泌VEGF，并与附近的血管内皮细胞里存在的叐体结合从而诱导血管新生11）。关于此过程的信号转导的研究很多，但依然有许多与明点。作者使用经典的通路MAP kinase cascade 相关的磷酸化抗体来研究2-Cl-C.OXT-A 的作用。图3 所示，添加了2-Cl-C.OXT-A 10-15 分钟后，促进HUVEC 的MAP kinaseERK1/2 的磷酸化，同时下游的MAP kinase MEK 的磷酸化也改发。MEK inhibitor PD98059 不但会被2-Cl-C.OXT-A 抑制ERK1/2 的磷酸化，还会抑制HUVEC 的管腔形成。最后，由于2-Cl-C.OXT-A 的促进管腔形成作用，它激活了MEK 相关的信号转导系统。另外，在上游里添加VEGF 叐体的抑制剂SU5416 ， 对2-Cl-C.OXT-A 活性化ERK1/2 没有影响，2-Cl-C.OXT-A 的作用点在其下游和MEK 的上游之间。

用In vivo检验2-Cl-C.OXT-A 的血管新生作用，在In vivo作用下用鸡胚尿囊绒膜和兔角膜研究。图4 是鸡胚尿囊绒膜的实验（CAM assay）结果。在孵化第11 日的胚绒尿膜里添加添加剂，放置于20μl 的Matrigel 里，培养42-48 小时后的胚绒尿膜形态。阴性对照没有观察到新生血管，添加了VEGF、2-Cl-C.OXT-A 的凝胶上观察到新生血管，同时使附件的血管更靠近。兔角膜的使用方法（corneal micropocket assay）是在一边眼角膜里制作的口袋，埋入含有添加剂的Φ3mm X 厚度0.5mm 的EVA（Ethylene vinyl acetate copolymer）薄膜，7 天后观察。并在对眼里埋入无添加的薄膜作对照。阳性对照使用bFGF（basic fibroblast growth factor）。结果按照向薄膜延伸的新生血管的总长度来评价，无添加对照长度为1.62±0.85mm、bFGF 为6.96±1.18mm，然后2-Cl-C.OXT-A为5.72±0.46mm（各自n=5、mean±SE），2-Cl-C.OXT-A 与bFGF 阳性对照结论相同，证明2-Cl-C.OXT-A能有意增加血管新生。

从以上研究可看出2-Cl-C.OXT-A 在In vitro 里能促进HUVEC 的管腔形成、增殖、迁移。这个作用里似乎与MAP kinasecascade 的MEK 磷酸化（活性化）相关。使用鸡胚尿囊绒膜、兔角膜的In vivo 实验也确认有血管新生的作用。

2-Cl-C.OXT-A是分子量284 的合成低分子化合物。化学性非常稳定，2-Cl-C.OXT-A 粉末在常温下也可保存。作者制作2mM 的生理盐水溶液，保存在冰箱里，使用数月也没有变质。284 的分子量在药剂学上是可经皮肤、粘膜吸收的分子大小。如今为治疗疾病，有人采用注射、基因导入化学性、生物学性都与稳定的VEGF、FGF（Fibroblast growth factor）等的血管新生促进物质的方法。比起这些物质，2-Cl-C.OXT-A 可做成药膏、药贴、涂剂等，具有明显的优势。另外，在HUVEC 里确认了活性化的MAP kinase cascade 是在众多细胞里存在的信号转导系统。不仅只有血管内皮细胞里血管新生，也有可能对其他细胞其他功能产生影响。因此和光纯药推出2-Cl-C.OXT-A 研究用试剂，将对今后2-Cl-C.OXT-A 的相关研究十分有帮助。

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产品编号	品名	规格	包装
032-21541	2-Cl-C.OXT-A	细胞生物学	1mg
038-21543	2-Cl-C.OXT-A	细胞生物学	5mg

Tsukamoto, I. et al .: “A novel nucleic acid analogue shows b angiogenic activity. ”, Biochem Biophys Res Commun., 399(4), 699-704(2010).