血液中游离DNA萃取用试剂的开发

来源：Seebio.cn作者：西宝生物人气：-发表时间：2012-01-12 14:59:00【大中小】

血液中游离DNA萃取剂的开发

DNA萃取剂法
1991年笔者们开发了作为当时DNA萃取试剂主流的、不使用苯酚或者氯仿等剧毒物质、而是在一根微型离心管中，进行连续操作的DNA萃取法“DNA萃取剂法”。DNA萃取剂是作为强蛋白质溶化剂而为大家所熟知的方法，我们利用该性质完成了简便且具有高回收率的DNA萃取法。该方法是一种使用DNA萃取剂与蛋白质分解酶或者界面活性剂等物质，将蛋白质可溶化后，通过单纯地添加醇类，优先沉淀/浓缩DNA的简便方法。
在利用DNA萃取剂制造的试剂中，有适用于生物制剂（DNA Extractor Kit：编号No. 295-50201）、全血液、组织（DNA Extractor WB Kit：编号No. 291-50502）、毛发、指甲（DNA Extractor FM Kit：编号No.295-58501）、全血液、组织中的线粒体DNA（mtDNA Extractor WB Kit：编号No. 293-54401、mtDNA Extractor CT Kit：编号No. 291-55301）等各种对象的产品，其高回收率在作为从微小的试剂中萃取极微量的DNA的试剂方面受到了好评。而且，由于DNA萃取剂是一种很难向DNA中添加人为的氧化物的萃取方法，所以也作为检测作为DNA损伤标记8-hydroxy-2’-deoxyguanosine（8-OH-dG）时的前处理试剂一直被广泛地应用。
此次，笔者们发现，DNA萃取剂法具有可以高收率地萃取微量的DNA的优秀特性，把它开拓为新的DNA萃取剂具有极大的可能性。

血液中游离DNA
我们已经广泛地得知肠癌中多阶段遗传因子变异为代表的癌抑制遗传因子的惰性化及癌遗传因子活性化等多种变异会诱发癌变。对于以ras、p53或者BRCA-1为代表的称为癌相关遗传因子的遗传因子群，不只是研究其与诱发癌症相关的活动与结构，还成为了开发利用这些的癌症诊断方法的研究对象。遗传因子诊断法具有潜在的力量，近年来在癌症的早期诊断方法的开发方面发挥着中心作用。期待着其他与以前的肿瘤标记相同的使用血液的简便且非侵袭的诊断方法。
从十九世纪七十年代初开始，不只是癌症患者，在全身性红斑狼疮（SLE）等各种患者中，也出现了通过细胞的死亡与组织的伤害产生的游离DNA被血清（血浆）输送出来的报告。其中，多数的报告为检查出癌的相关遗传因子，所以期待着把这种血液中游离DNA（plasma DNA）特别应用于癌的遗传因子的诊断法中。
例如：有报告说明，血液中游离DNA的浓度与癌的发展与大小相关，在检查出有p53与K-ras遗传因子变异的患者中，经过肿瘤摘除手术后，如果在血液中游离DNA中继续检查出变异遗传因子，那么再发与转移的可确定率将很高，利用CEA等以前的标记也可以高概率地检测出这些情况。
而且，使用血液中游离DNA的特定的微型卫星解析不只用于早期诊断，在对极可能患癌的高风险患者的诊断方面也表现出可以期待的可能性。而且，正在考虑对以非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer）为代表的肺癌等癌症使用血液中游离DNA检测p16癌抑制遗传因子的高甲基化作用将成为诊断癌症再发的强有力手段。
在血液中游离的DNA的检测/解析中，隐藏着这种可能性，今后也将成为受人瞩目的研究材料。所以，笔者们把利用“DNA萃取剂”的DNA萃取法作为血液中游离DNA分析的前处理试剂进行了适当的新萃取试剂的开发。
为了萃取人的血清（血浆）中浮游的DNA，此次开发的试剂调整了反应条件与试剂的组成，而且把调整后使其可以适应去除血液中含有的多种脂肪成分的乙醇液体配套化（商品名DNA Extractor SP Kit：编号No. 296-60501）。在这里，在介绍本新产品的内容的同时，介绍使用该试剂萃取血液中游离的DNA，进行放大检测的实施实例。

DNA Extractor SP Kit：构成试剂
（使用100μl的试剂，分50次处理）
（1）酶反应液 10ml×1支
（2）蛋白质分解酶液体 250μl×1支
（3）DNA萃取剂溶液 15ml×1支
（4）乙醇液体 30ml×1支
（5）洗涤液（A） 50ml×1支
（6）洗涤液（B） 50ml×1支

DNA Extractor SP Kit：原醇
（1）把血清（血浆）添加至100μl、1.5ml微型离心管中。
（2）添加200μl的酶反应液体。
（3）添加5μl的蛋白质分解酶液体，用涡流搅拌器混合。
（4）在56℃的条件下保温10分钟。
（5）添加300μl的DNA萃取剂溶液，轻轻地混合。
（6）添加600μl的乙醇溶液，用涡流搅拌器混合。
（7）在室温下放置10分钟。
（8）使用12,000～20,000×g，在室温下离心分离10分钟。
（9）弃掉上清液，在纸巾上尽量去除上清残液。
（10）在沉淀中添加1ml的洗涤液（A），用涡流搅拌器混合。
（11）使用12,000～20,000×g，在室温下离心分离5分钟。
（12）进行与步骤9同样的操作，尽量去除上清残液。
（13）在沉淀中添加1ml的洗涤液（B），用涡流搅拌器混合。
（14）使用12,000～20,000×g，在室温下离心分离5分钟。
（15）进行与步骤9同样的操作，尽量去除上清残液。
（16）利用块状加热器（约65℃）等把沉淀干燥5分钟。
（17）在干燥后的沉淀中添加适量的TE(pH 8.0)等，用涡流搅拌器混合。
（18）利用块状加热器（约65℃），持续加温3～5分钟左右，利用涡流搅拌器搅拌，使沉淀完全溶解，制作成DNA试样。

实施实例（方法）
使用DNA Extractor SP Kit，从正常人的血清（10检查样品）及血浆（1检查样品）中萃取DNA，对于溶解在20μl的TE（pH 8.0）的DNA试样中的5μl（相当于25μl的血清或者血浆），进行p53-Exon5区域及p53-Exon7区域的PCR放大。各种反应中使用的底剂为NIPPONJIN公司的p53 Primers （Exon5：编号No. 312-03511, Exon7：编号No.316-03531）。而且，作为比较对照，使用了以多数的关于血液中游离DNA解析的文献中使用的硅载体（离心过滤）法作为原理的A公司DNA精制试剂萃取的DNA，作为试样添加了在1次的PCR中相当于25μl的血清或者血浆的DNA溶液。

（结果）
关于利用本试剂萃取的检查样品，在Exon5的PCR中可以确定所有的检查样品的放大断片。在Exon7的PCR中，只有1个检查样品（检查样品编号③）没有确定放大断片，其余的均可以检测出放大断片。而且，结果，关于PCR扩大断片的DNA量，在所有的检查样品中，对于利用本试剂萃取的DNA的扩大结果明显比对于利用A公司的试剂萃取的DNA的扩大结果（得到粗带），表示出本试剂的DNA萃取效率的高度。
关于Exon7的未能检测出的检查样品，通过下述的实验，在多少改变PCR条件进行再次试验的结果，可以得到扩大的断片。利用再次进行试验得到的扩大断片，可以显示出即时从100μl的少量的检查样品中萃取时，从研究的所有的检查样品中可以进行p53遗传因子的PCR扩大（向PCR供给的检查样品量相当于25μl）。

总结
根据此次的结果，作为DNA Extractor SP Kit的特征，可以显示出“高DNA回收率”。可以认为高收率地得到血液中游离DNA与提高上述的患病相关的遗传因子的检测灵敏度与分析的精度相关联，是一种有利于诊断方法开发研究的进步试剂。如果各位能够对本试剂产生兴趣，对各位的研究有所帮助，我将很高兴。