ATP，是生命体基本的能量分子，一种通用的能量“货币”。ATP参与多种酶促反应，维持正常的生命活动。通过ATP检测，可以间接定量测定细菌、细胞的数量和活性状态，了解体外ATP参与的酶促反应的进程，在生物检定和生命科学研究中有广泛的应用。本试剂盒采用生物发光(bioluminescent)法，依据荧光素酶(luciferase)催化底物荧光素的转化，利用ATP的能量，发射出光子。萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase)催化的发光反应，与ATP浓度具有很好的线性依赖关系和极高的敏感性，ATP的检测灵敏度达到10^-13 mol。本试剂盒采用优化的酶反应体系，使发光反应持续数十分钟，以便于手工操作多个样品。操作简便，可快速获得结果。

产品内容与储存方法：

可作200次以上ATP检测。低温运输，-20℃或-80℃避光保存。有效期6个月。

所需其它试剂：使用者需准备PBS 、双蒸水等。

操作方法：

样品准备：

对于细胞或微生物样品，应首先提取ATP。本试剂盒提供培养哺乳细胞的ATP提取方法如下。其它标本来源的ATP提取，一般可用三氯乙酸的提取方法，或参照文献一些有效提取方法进行。对体外酶促反应样品，一般可直接用双蒸水稀释后进行检测。样品中ATP含量应稀释到0.1 mM一下，以保证在测定的线性范围内。

培养哺乳细胞样品准备：

1) 配制裂解液：临用前，取适量100x Lysis Buffer (ULB)，用双蒸水稀释至1xLB，混匀。1xLB可长期冻存于-20℃。

2) 细胞清洗：倾去培养板/皿中的培养液，加入足量PBS，轻轻洗涤细胞。完全倾去洗涤液。

3) 细胞裂解：在孔/皿中加入足量1xLB，混匀。培养板可在微型振荡器上震荡5~10 min；培养皿可直接用细胞刮刀刮下细胞，将细胞悬液移入1.5 ml离心管，在涡旋振荡器上充分混悬震荡30秒。裂解细胞悬液可直接用于发光测定，也可离心30秒，取上清做发光测定。裂解细胞含量较多时，可将样品用双蒸水稀释，以保证在测定ATP的线性范围内。

配制发光反应液：

测定前，在室温待ATP Assay Buffer和Luciferin溶化，混匀（注意避光）。按20/1比例用ATP assay Buffer稀释Luciferin，再加入1/10体积的Luciferase，配制所需体积的Assay Reagent（注意避光），置冰上待用。

配制ATP标准液：

测定前，在室温待ATP溶化，用双蒸水或1xLB稀释成一定浓度梯度的溶液。该浓度梯度应在0.1 nM~0.1 mM的浓度范围内的一定区间，并涵盖样品ATP浓度的测定范围。

测定仪器的设置：

按仪器操作说明开启发光测定仪。手动操作型仪器，将测读时间设为10-20秒。自动操作型仪器，一般将测定延迟设为2秒，将测读时间设为10-20秒，Assay Reagent的注入体积设定为50 μl。

手动发光测定：

取待测样品5 μl加入测量管底部，取Assay Reagent 50 μl加入管底部，轻轻敲击管壁3~5次混匀，放入仪器中立即测定，记录发光值为Firefly luciferase的发光单位(RLU)。如用多孔板同时手动测定多个样品，则将各待测样品5 μl分别加入连续的各孔底部，用多道加样器于各孔底加入Assay Reagent 50 μl，轻轻敲击板侧3~5次混匀，放入仪器中立即测定，记录发光值为Firefly luciferase的发光单位(RLU)。

自动发光测定：

配制好的Assay Reagent置于测定仪内并连接好对应管道。各待测样品5 μl分别加入测定管/板孔底部，启动自动测量程序。记录Firefly luciferase的发光单位(RLU)。

注意事项：

1) Assay Buffer，Luciferin和Luciferase应避免反复冻熔，可分装成合适体积分次使用。配制好的Aassay Reagent不能长期保存。

2) Luciferase活性可被多种物质如一些去污剂抑制，设计和分析实验结果时，应考虑到这个因素。

3) 测定样品量可设定为2~20 μl；Assay Reagent加入量也可增加至100 μl。但应保持整个实验的一致性。

4) 用多孔板同时手动测定多个样品时，要尽量缩短样品间试剂加入的时间间隔。

5) ATP检测的灵敏度与样品处理方法、发光测定仪器的灵敏度等均有关系。可先进行一个简单的预实验以确定设计实验的灵敏度和ATP检测的线性范围。

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