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可用于活细胞的GST活性检测探针 DNs-Rh

来源：作者：人气：-发表时间：2023-10-16 08:47:00【大中小】

可用于活细胞的GST活性检测探针

DNs-Rh ＜Cell-based GST Activity Assay Reagent＞

DNs-Rh是可以在活细胞中观察Glutathione S-transferase（GST）酶活性的荧光探针。由于可以根据GST活性发出绿色荧光，可用于评价细胞内GST的活性。GST亚家族跨度广泛，可以实现总GST活性的可视化。

※本产品基于名古屋大学理学研究科阿部洋教授的研究成果商品化。

※本产品仅供科研，严禁用于科研以外用途。

DNs-Rh具有细胞膜透过性，随着细胞内GST酶活性改变而产生绿色荧光。通过显微镜或流式细胞仪定量荧光强度，从而实现GST活性的相对定量。

◆GST及其活性检测方法

Gluthathione S-Transferase（GST）家族广泛存在于细菌及动植物中，细胞内的疏水性外源物质（xenobiotics）被添加到gluthathione（GSH）中，具有转换为GSH缀合物（GSH-conjugate）的活性。GSH缀合物通过MRP（multidrug resistance-associated protein）运输积极地排出细胞外，存在去除异物的机制。因此，GST可以作为排出具有潜在细胞毒性的外源性物质的解毒因子而发挥作用。

另一方面，由于大多数的抗癌剂等医药品也是通过GST转换为GSH缀合物排出细胞外，GST作为耐药因子具有削弱药效的负面效果。尤其是随着癌症的恶化特定的GST同种型（GSTP₁）的表达量增强，癌细胞获得了强耐药性。

GST既是异物代谢和解毒作用因子，也具有耐药性因子的作用。因此，需要合适的检测细胞内GST活性的技术，但传统方法仅限于in vitro 的活性检测，缺少在活细胞内观察活性的方法。

名古屋大学阿部洋教授及其研究人员们开发的DNs-Rh是细胞膜透过性的化合物，是一种可以根据GST酶活性产生绿色荧光的GST活性应答探针。因为可以用于活细胞，进行各类细胞的GST活性的定量化和刺激依赖性的GST活性的监测，可以用于传统方法无法实现的基于细胞水平的抑制剂的开发等的各种应用。

GST作用示意图

>GST活性检测用探针的比较

>探针名称			传统方法（CDNB）	DNs-Rh
>检测方法			UV（~340 nm）	绿色荧光（Ex / Em = 496 / 520 nm）
>检测对象			广泛的GST家族	广泛的GST家族
>适用实验	in vitro（如裂解液或纯化酶）		可以	可以
	>活细胞实验	>成像	不可以	可以
		>流式细胞术	不可以	可以
>检测灵敏度			低（UV测定）	高（荧光测定）
>高通量和简便性			低（需要配制裂解液）	高（活细胞状态下观察）
>非特异性反应（GST非依赖的GSH反应性）			高	低
>与其他的因子同时检测			不可以	可以（可以和蓝色和红色荧光同时使用）

◆详细原理

DNs-Rh是在Rhodamine110上添加2个GST基质2,4- dinitrobenzene sulfonamide（DNB）的化合物，呈消光状态。DNB基质通过GST转换为GSH缀合体，Rhodamine 110释放出来并发出绿色荧光（激发／荧光 = 496 / 520 nm）。DNs-Rh最初开发作为检测体内硫醇的试剂^1），但后来却被发现其也能高效用作GST活性的检测试剂^2）。与硫醇应答相比，GST应答性更强，现在我们期待DNs-Rh能成为活细胞用的GST活性检测探针^4）。

原理示意图

◆参考文献

1. Shibata, A.,et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 18, 2246-2249 (2008) [PMID:18358719] "Rhodamine-based fluorogenic probe for imaging biological thiol."

2.Alander, J., et al., Anal. Biochem., 390, 52-56 (2009) [PMID:19348782] "Characterization of a new fluorogenic substrate for microsomal glutathione transferase 1."

3.Zhang, J.,et al., J. Am. Chem. Soc., 133, 14109-14119 (2011) [PMID:21786801] "Synthesis and characterization of a series of highly fluorogenic substrates for glutathione transferases, a general stategy."

4.Shishido, Y., et al.,ChemBioChem., (in press) "A covalent inhibitor for Glutathione S-Transferase Pi (GSTP1-1) in human cells."

◆特点

●　根据GST活性释放rhodamine110产生绿色荧光（激发/荧光=496/520 nm）。

●　具有细胞膜通透性，只需添加至培养基即可使用。

●　已确认与各种GST家族具有交叉反应性

◆应用实例

>荧光光谱（反应前后）

向GSTP₁重组体（10 μg/mL）中添加DNs-Rh（1 μM）、GSH（1 mM）30分钟后，测定激发光为490 nm时的荧光光谱。仅在GSH / GSTP₁存在时观察到了Em_max520 nm附近的荧光。

荧光光谱

GST in vitro活性检测

向GSTP₁重组体（10 μg/mL）中添加DNs-Rh（1 μM）、GSH（1 mM）观察绿色荧光强度（Ex / Em 490 / 520 nm）随时间的变化，纵轴将1 μM Rhodamine 110溶液的荧光强度设为100%。GST存在时，可以发现（GSH（＋）/ GST（＋））在约30分钟左右的时候荧光强度明显增强，约55%的探针转换成Rhodamine，相对的，在GSH（＋）/ GST（?）的条件下，可以观察到GSH稍微有所增加，但是Rhodamine的转换率只有3%。

※ 正如原理所述，DNs-Rh与硫醇化合物反应甚微。与GST存在时相比反应明显较弱，但是也有可能经过几个小时的长时间反应使荧光强度增强，因此建议在反应30~60分

※ 钟左右后即刻进行观察。

>活细胞荧光测定

>培养细胞中的GST活性测定

向HeLa细胞中添加2.5 μM的DNs-Rh，孵育30分钟后用荧光显微镜（Ex 480 / Em 535 nm）进行观察。添加1 mM的不可逆性抑制物质CNBSF（#FDV-0031）作为前处理，反应15分钟。通过DNs-Rh 从细胞内观察到 Rhodamine 110 的绿色荧光，但是用抑制物质 CNBSF 进行前处理时，荧光强度明显减弱。

※ 成像注意：本试剂是通过观察GST释放出来的rhodamine 110在细胞内的分布，虽然可以基于荧光强度观察GST的相对活性强度，但不能实现细胞内GST定位的可视化。