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可荧光定量活细胞的脂肪酸β-氧化（FAO）活性的试剂 - FAOBlue

来源：作者：人气：-发表时间：2023-10-10 09:32:00【大中小】

可荧光定量活细胞的脂肪酸β-氧化（FAO）活性的试剂

FAOBlue

FAOBlue是一款可以通过蓝色荧光可视化脂肪酸分解的共同途径——脂肪酸β-氧化（FAO）的活性的试剂。

通过荧光成像，可以简单地检测出过去难以检测的活细胞中的脂肪酸β-氧化活性。

该产品可广泛应用于对比评估不同细胞种类之间的β-氧化，探索促进或抑制β-氧化活性的化合物，β-氧化相关酶群的基础研究等领域。

※　本产品基于九州大学研究生院药学研究院药物发现化学生物学领域王子田彰夫教授的研究成果，

※　由Funakoshi株式会社商品化并销售。

※　本产品仅供研究使用。

使用FAOBlue可视化HepG2细胞的FAO活性

添加FAOBlue到HepG2细胞中，观察活细胞成像，可从细胞中观察到蓝色荧光。另一方面，若使用FAO抑制剂进行前处理，则荧光强度明显减少，由此可知，蓝色荧光的强度取决于FAO的活性。

◆何为脂肪酸β-氧化（Fatty acid beta-oxidation; FAO）

脂肪酸是构成细胞的各种脂质的基本要素，与葡萄糖、氨基酸并称为能源。尤其是在葡萄糖不足而饥饿的时候，脂肪酸会分解活跃，产生大量的ATP。虽然脂肪酸根据碳链的长短以及不饱和度的差别而存在不同的种类，但是由于它的分解属于线粒体等细胞器的共同分解途径，因此这种途径被统称为脂肪酸β-氧化（Fatty acid beta-oxidation; FAO）。

脂肪酸β-氧化主要通过4步酶反应——1）脂肪酸β位的氧化，2）β位的水合，3）β位的氧化，4）裂解，被阶段性分解为2个碳原子的短链脂肪酸和作为ATP原料的乙酰CoA。其中生成的2个碳原子的短链脂肪酸再通过同一个循环，以2ⁿ个碳原子的短链脂肪酸重复分解。

研究提出，癌症以及非酒精性肝炎（NASH）等疾病中，脂肪酸β-氧化会出现很大的变动，因此开发检测脂肪酸β-氧化活性的方法备受期待。然而，在活细胞中检测多种酶参与的脂肪酸β-氧化一直以来都十分困难。

FAOBlue是一款新型脂肪酸β-氧化应答型荧光探针，由九州大学研究生院药学研究院、专攻药物发现化学生物学领域的王子田彰夫教授开发。只需将产品添加到培养基中的简单操作，便可以通过荧光观察定量脂肪酸β-氧化活性。

◆原理

FAOBlue是一种在碳原子数为9的壬酸的碳链末端添加了蓝色荧光色素香豆素衍生物的化合物，此外，通过用乙酰氧基甲基酯保护末端脂肪酸来提高细胞膜透过性。虽然FAOBlue中含有香豆素衍生物，但是在该状态下，它不会在405 nm激发下发出荧光。

1. 附着在羧基的乙酰氧甲基具有高疏水性，因此FAOBlue可以跨越细胞膜，有效地摄入到细胞中。

2. 通过细胞内的酯水解酶去除乙酰氧基甲酯，转换成游离脂肪酸的形态。

3. 通过脂酰CoA合成酶转换成脂酰CoA，摄入β-氧化途径。

4. 通过β-氧化循环壬酸（C9）按庚酸（C7）、戊酸（C5）、丙酸（C3）的顺序转换，在第四次β-氧化循环的丙酸

4. 被分解时，香豆素衍生物被释放出来。香豆素衍生物在405 nm激发下发出蓝色荧光。

5. 由于游离的香豆素衍生物扩散到整个细胞中，因此通过检测细胞内的蓝色荧光强度，可以实时且定量的评价β-氧化活性。

※　通过添加肉碱穿梭抑制剂的Etomoxir，有效地抑制了细胞内的荧光上升。

※　该结果证明FAOBlue主要检测线粒体的FAO活性。

◆特点

●　FAOBlue处于消光状态，分解后的游离香豆素衍生物呈现出比分解前更高的荧光强度。

●　添加培养基后，30 min~120 min后便可观察。

●　无需特别操作即可检测β-氧化活性。

●　实例验证能观察多种细胞类型的β-氧化。

●　有抑制药物依赖性β-氧化和因促进而引起的活性变化的成功检测案例。

●　检测波长：激发405 nm/荧光460 nm。

※　注意：

使用共聚焦激光显微镜时，推荐使用405 nm激光激发。如果本试剂在330～380 nm的范围内激发的话，会观察到无关FAO活性的370～450 nm（最大荧光波长410 nm）的荧光。使用荧光显微镜时，为了特异性观察FAO活性，推荐选择激发波长在390～430 nm范围内的激发光滤光片。详情请参考数据实例：FAO特异性吸收光谱、荧光光谱的变化。

◆原著论文

Uchinomiya et. al., Chem. Commun. 56, 3023～3026 (2020) . ”Fluorescence Detection of Metabolic Activity of Fatty Acid Beta Oxidation Pathway in Living Cells.”

◆应用

●　评价各种细胞的β-氧化活性

●　β-氧化相关的基因基础研究

●　抑制或促进β-氧化的化合物的探索等

◆操作方法概况

1. 在HBS中溶解FAOBlue至终浓度为5~20 μM^*1。

*1 针对不同的细胞类型，合适的浓度有所差异。建议根据具体实验进行探讨。

2. 去除培养基，用HBS清洗细胞2次。

3. 向细胞添加含有FAOBlue的HBS。

4. 在37°C下培养30 min以上^*2。

*2 针对不同的细胞类型，合适的培养时长有所差异。建议根据具体实验进行探讨。

5. 更换培养基后^*3，通过成像观察蓝色荧光（Ex. 405 nm/Em. 430～480 nm）。

*3 染色后的培养基更换是非必须的。即使不清洗也可进行观察。

实验注意点

由于本试剂使用405 nm的激发光，根据不同的观察对象，可能会观察到其自发的荧光。建议同时进行未添加本试剂的阴性对照实验。尤其是在显微镜下观察到点状荧光信号时，可能就是细胞的自发荧光。

◆应用实例

FAO特异性吸收光谱、荧光光谱的变化

FAOBlue以及香豆素衍生物的吸收光谱（左）和荧光光谱（右）。

FAOBlue在通过FAO转换成香豆素衍生物后，吸收最大值由350 nm变为405 nm的长波长。因此，在405 nm的激发条件下，FAOBlue不会发出荧光，只有在通过FAO释放香豆素衍生物时才会发出蓝色荧光。

※　注意：

若使用处于FAOBlue的吸收最大值350 nm左右的光激发，FAOBlue也会发出蓝色荧光（380～450 nm；最大波长400 nm）。若在荧光显微镜中使用普通的DAPI滤光片，将会同时激发未反应的FAOBlue以及FAO反应后的香豆素衍生物。所以在选择滤光片时请格外注意。

可视化各种细胞类型中的FAO活性

在4种癌细胞中加入FAOBlue，培养一定时间后进行荧光观察。所有细胞都观察到了蓝色荧光，而添加FAO抑制剂etomoxir后荧光显著衰减，由此可知，蓝色荧光是由FAO活性引起的。

※ 各种细胞的实验条件有所不同。

※ HepG2 : 5 μM, 30 min

※ LNCaP: 20 μM, 120 min

※ HeLa : 20 μM, 120 min

※ A549 : 5 μM, 30 min

观察刺激依赖性β-氧化的变化

向HepG2细胞添加脂质代谢促进剂AICAR^*2（200 μM，3 h）或部分FAO抑制剂ranolazine（200 μM，12 h）进行前处理后，添加FAOBlue（5 μM）培养30 min。进行荧光观察时，可以看到对比对照实验（未处理），AICAR中荧光强度明显增强，ranolazine中荧光强度明显降低。

＊2 AICAR : AMPK（AMP-activated protein kinase）活化剂具有活化脂质代谢的功能。

药物作用的定量分析

使用FAOBlue可以定量分析药物对FAO的效果。用非酒精性脂肪肝疾病（NAFLD）的候选治疗药ND-630（acetyl-CoA carboxylase inhibitor）前处理HepG2细胞4 h后，添加FAOBlue（5 μM）培养30 min。使用共聚焦激光显微镜评价蓝色荧光强度时，可以观察到依赖于ND-630浓度的荧光强度增加。由此可知，ND-630增强了FAO的活性。

NASH模型小鼠分析

非酒精性肝炎（NASH）是一种与脂质相关的疾病，已知会降低脂肪分解的速度。向正常小鼠和NASH模型小鼠以口服形式给药增强脂质代谢的bezafibrate后，回收其肝脏制备初代培养肝细胞。向各个细胞加入FAOBlue（5 μM）观察其FAO活性，结果显示，对比正常小鼠来源细胞，NASH模型小鼠来源细胞的FAO活性明显被抑制。另一方面，我们可以看到给药bezafibrate的NASH模型小鼠来源细胞中FAO恢复了活性。

本试剂可用于脂质相关疾病模型中的FAO定量分析。