“小标记”“大变身” - 新升级辣根过氧化物酶（HRP）

来源：作者：人气：-发表时间：2024-12-20 13:07:00【大中小】

一、背景介绍

辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）广泛地分布于植物界，以辣根中含量最高，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉辅基组成的一种糖蛋白，含18%的中性糖和氨基糖，主要有甘露糖、木糖、阿拉伯糖和己糖胺等。HRP由300个氨基酸和4个二硫键连接而成，相对分子质量为40000，等电点为5.5～9.0，最适pH为5～5.5，最适温度40～45℃，易溶于水和58%以下的饱和硫酸铵溶液。它是一种复合酶，是由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结合而成的一种卟啉蛋白质。

辣根过氧化物酶的主酶是无色糖蛋白，与酶活性无关，辅基是深棕色的含铁卟啉环，是酶活性基团，酶纯度又称为RZ值，来源于德文Reinheit Zahl。一般将其作为辣根过氧化物酶的纯度指标，含有铁卟啉的蛋白质或酶在400nm附近存在一个非常强的吸收带，辣根过氧化物酶中含有铁卟啉，因此天然的HRP在403nm处有特殊的吸收光谱，而蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸在275nm左右具有强吸收带。所以对于辣根过氧化物酶而言，RZ的定义是同一浓度酶溶液在403nm与275nm两个波长光密度的比值。

RZ值仅仅只能说明血红素基团在辣根过氧化物酶中的含量，并非表示其制剂的真正纯度，而RZ值高的制剂，也并不意味着酶活性高。RZ值与酶活性无关，酶活性是以单位U表示的，即1min将1μmol底物转化为产物所需的酶量。免疫标记中高纯度的酶 RZ 值应在 3.0 左右(最高可达 3.4)。为满足不同领域不同研发需求，西宝生物可提供多种RZ值的酶产品。

依据不同用途，可选用不同类型的商品

产品类型	主要应用
RZ>3 活性>250u/mg	主要应用于免疫学上抗体的标记，是高纯度的过氧化酶。采用特殊色谱纯化技术以除去会影响免疫学反应的同工酶B ，可作为酶免类体外诊断试剂盒的开发原料。
RZ>2 活性>180u/mg	主要应用于临床生化，例如总胆固醇检测（TC）、HDL-C、LDL-C、甘油三酯（TG）检测等，亦可用于实验初期蛋白质、抗体等标记。
RZ>1 活性>100u/mg	主要应用于生化领域血糖试纸和尿液分析试纸。

因此，在选择HRP时应同时考虑酶活力和RZ这两个数据，可以先考虑酶活性，其次是RZ值。，两者配合选择适合的酶产品。

IVD领域随着ELISA及酶促化学发光检测技术的发展，酶偶联抗体及其偶联方法受到广泛关注。目前常用的偶联方法有过碘酸钠氧化法、碳二亚胺法和SMCC异性双功能偶联法等。《BIOCONJUGATE TECHNIQUES》中介绍了NaIO4法标记HRP的原理（如图1）。

HRP标记抗体的主要方法是‌过碘酸钠法‌。这种方法的基本原理是将HRP的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，然后这个醛基与抗体的氨基（-NH2）反应，形成希夫氏碱（Schiff base）。为了防止HRP中糖的醛基与其自身蛋白的氨基发生偶合，通常会在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。氧化反应结束后，再用氰基硼氢化钠或硼氢化钠来稳定希夫氏碱‌。

图1 HRP标记抗体原理图

西宝生物专为工业生产开发新升级HRP（ECE0066Z）产品，本次我们全新升级后的产品性能稳定可靠，在各种复杂的使用环境中都能始终保持优异的表现。高活性的特点为生化、免疫诊断试剂产品的开发注入了强大动力；单批次产量稳定，这意味着无论您是小规模的研发需求，还是生产的大规格使用，都能得到充分满足；它的适应性极强，适合不同的应用场景，无论是实验室研发，还是大规模生产，都能精准助力，成为您的得力助手。

Seebio 辣根过氧化物酶的特点：

•纯化形式——冻干无盐粉末；即用型溶解和使用

•比活性高——通常大于 270 U/mg（具体酶活可参考COA）

•批间稳定——严格品控，极小批间差异

Seebio新升级辣根过氧化物酶（HRP）产品详情

产品编码	ECE0066Z
产品名称	Peroxidase
CAS号	9003-99-0
生物来源	Horseradish
RZ值	≥3.0
比活	≥270 U/mg
分子量	~44kDa
外观	Red-brown lyophilizate，salt-free
储存	-20℃，避光防潮密闭干燥

Seebio新升级辣根过氧化物酶（HRP）实用案列介绍

表1 HRP酶参数

参数	进口R品牌*HRP酶	进口M品牌*HRP酶	西宝HRP酶
RZ	/	/	≥3.0
活性(U/mg)	100KU/384mg	/	≥270.0u/mg
外观	棕色	棕色	红棕色冻干粉

二、性能对比（IVD项目采用高碘酸钠法标记）

2.1标记抗体测试酶活（NaIO4法）-双抗体夹心法体外诊断项目

2.1.1实验步骤

a）HCG抗体1（货号:EKY0361A）包被；

b）进口R品牌、进口M品牌、西宝HRP酶分别标记HCG抗体2（货号:EKY0360A）（NaIO4法）；

c）配置6个浓度HCG阳性尿液梯度及空白；

d）加样，每个浓度2次重复，孵育及洗涤；

e）在洗涤完成的加入底物，在酶标仪上测试OD值。

2.1.2实验结果

表2 西宝HRP（ECE0066Z）三批次与进口R品牌HRP酶比对（夹心法）

HCG阳性梯度	进口R品牌HRP OD值	西宝HRP批次 OD值	西宝HRP批次2 OD值	西宝HRP批次3 OD值	西宝HRP批次1与进口R品牌偏差	西宝HRP批次2与进口R品牌偏差	西宝HRP批次3进口与R品牌偏差
原液	2.904	2.750	2.838	2.891	-5.3%	-2.3%	-0.4%
稀释2倍	1.368	1.264	1.392	1.276	-7.6%	1.8%	-6.7%
稀释4倍	0.678	0.680	0.693	0.669	0.3%	2.2%	-1.3%
稀释8倍	0.479	0.450	0.450	0.464	-6.2%	-6.2%	-3.3%
稀释16倍	0.219	0.232	0.222	0.215	5.9%	1.1%	-1.9%
稀释32倍	0.154	0.166	0.142	0.144	8.1%	-7.9%	-6.4%
空白	0.081	0.083	0.077	0.079	1.6%	-5.3%	-2.5%
平均偏差					-0.5%	-2.4%	-3.2%

由表2实验数据可知，西宝生物三批次HRP酶标记抗体与进口R品牌HRP酶标记抗体测试HCG项目（双抗体夹心法）OD均值偏差分别为-0.5%、-2.4%、-3.2%。表明西宝生物三批次HRP酶批间差异小，与进口R品牌的HRP性能相当，可实现直接升级替换。

表3 西宝HRP（ECE0066Z）三批次与进口M品牌HRP酶比对（夹心法）

HCG阳性梯度	进口M品牌HRP OD值	西宝HRP批次1 OD值	西宝HRP批次2 OD值	西宝HRP批次3 OD值	西宝HRP批次1与进口M品牌偏差	西宝HRP批次2与进口M品牌偏差	西宝HRP批次3与进口M品牌偏差
原液	2.879	2.750	2.838	2.891	-4.5%	-1.4%	0.4%
稀释2倍	1.397	1.264	1.392	1.276	-9.5%	-0.4%	-8.7%
稀释4倍	0.729	0.680	0.693	0.669	-6.7%	-5.0%	-8.3%
稀释8倍	0.477	0.450	0.450	0.464	-5.7%	-5.7%	-2.7%
稀释16倍	0.227	0.232	0.222	0.215	2.6%	-2.1%	-4.9%
稀释32倍	0.156	0.166	0.142	0.144	6.7%	-9.0%	-7.6%
空白	0.081	0.083	0.077	0.079	1.8%	-5.1%	-2.3%
平均偏差					-2.2%	-4.1%	-4.9%

由表3实验数据可知，西宝生物三批次HRP酶标记抗体与进口M品牌HRP酶标记抗体测试HCG项目（双抗体夹心法）OD均值偏差分别为-2.2%、-4.1%、-4.9%。表明西宝生物三批次HRP酶批间差异小，与进口M品牌的HRP性能相当，可实现直接升级替换。

2.2标记抗体测试酶活（NaIO4法）-竞争法法项目

2.2.1实验步骤

a）兔IgG（货号:EKN0347A）包被；

b）进口R品牌、进口M品牌、西宝HRP酶分别标记羊抗兔抗体（货号:ECY4491C）（NaIO4法）；

c）配置7个浓度羊抗兔抗体梯度及空白；

d）加样，每个浓度2次重复，孵育及洗涤；

e）在洗涤完成的加入底物，在酶标仪上测试OD值。

2.2.2实验结果

表4 西宝三批次HRP与进口R品牌HRP酶比对（竞争法）

浓度	进口R品牌HRP OD值	西宝HRP批次1 OD值	西宝HRP批次2 OD值	西宝HRP批次3 OD值	西宝HRP批次1与进口R品牌偏差	西宝HRP批次2与进口R品牌偏差	西宝HRP批次3与进口R品牌偏差
原液	0.383	0.407	0.394	0.429	6.4%	3.0%	12.1%
稀释2倍	0.458	0.479	0.443	0.431	4.5%	-3.2%	-5.9%
稀释4倍	0.578	0.625	0.577	0.594	8.1%	-0.2%	2.7%
稀释8倍	0.869	0.833	0.846	0.834	-4.0%	-2.6%	-4.0%
稀释16倍	1.229	1.195	1.139	1.108	-2.7%	-7.3%	-9.8%
稀释48倍	1.890	1.913	1.879	1.846	1.2%	-0.6%	-2.3%
稀释192倍	2.691	2.926	2.799	2.748	8.8%	4.0%	2.1%
空白	3.655	3.710	3.700	3.656	1.5%	1.2%	0.0%
平均偏差					3.0%	-0.7%	-0.6%

由表4实验数据可知，西宝生物三批次HRP酶标记抗体与进口品牌HRP酶标记抗体测试竞争法项目OD均值偏差分别为3.0%、-0.7%、-0.6%。表明西宝生物三批次HRP酶批间差异小，与进口R品牌的HRP性能相当，可实现直接升级替换。

表5 西宝三批次HRP与进口M品牌HRP酶比对（竞争法）

浓度	进口M品牌HRP OD值	西宝HRP批次1 OD值	西宝HRP批次2 OD值	西宝HRP批次3 OD值	西宝HRP批次1与进口M品牌偏差	西宝HRP批次2与进口M品牌偏差	西宝HRP批次3与进口M品牌偏差
原液	0.392	0.407	0.394	0.429	3.7%	0.4%	9.3%
稀释2倍	0.434	0.479	0.443	0.431	10.4%	2.2%	-0.6%
稀释4倍	0.557	0.625	0.577	0.594	12.3%	3.7%	6.7%
稀释8倍	0.830	0.833	0.846	0.834	0.4%	2.0%	0.5%
稀释16倍	1.174	1.195	1.139	1.108	1.8%	-3.0%	-5.6%
稀释48倍	1.810	1.913	1.879	1.846	5.7%	3.8%	2.0%
稀释192倍	2.828	2.926	2.799	2.748	3.5%	-1.1%	-2.8%
空白	3.675	3.710	3.700	3.656	0.9%	0.7%	-0.5%
平均偏差					4.8%	1.1%	1.1%

由表5实验数据可知，西宝生物三批次HRP酶标记抗体与进口品牌HRP酶标记抗体测试竞争法项目OD均值偏差分别为4.8%、1.1%、1.1%。表明西宝生物三批次HRP酶批间差异小，与进口M品牌的HRP性能相当，可实现直接升级替换。

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名称	货号	规格
辣根过氧化物酶，270U/mg,RZ≥3.0	ECE0066Z	100mg，500mg
辣根过氧化物酶，290-330U/mg，RZ≥3.0	ECE0066M	10mg，100mg，500mg
Seebio® 碱性磷酸酶(ALP)高活性	DCE0108L	5mg，25mg，100mg
碱性磷酸酶(ALP)	DCE0108K	5mg，25mg，100mg
链霉亲和素（SA）（含半胱氨酸）	ECL0006W	10mg，100mg
核心链霉亲和素（CSA））	ECL0006R	10mg，100mg
重组链霉亲和素（RSA）	ECL0006V	10mg，100mg
辣根过氧化物酶标记链霉亲和素（SA-HRP）	ECE0696C	1ml
β-亚基-人绒毛膜促性腺激素抗体（β-HCG Antibody）	EKY0361A	1mg，5mg
α-亚基-人绒毛膜促性腺激素抗体（α-HCG Antibody）	EKY0360A	1mg，5mg
Seebio® 兔IgG	EKN0347A	1mg，10mg，100mg
山羊抗兔IgG（H+L）	ECY4491A	5mg
单组份TMB显色液(高灵敏，ELISA HRP显色用)	DCD0506G	100ml
TMB显色终止液(450nm, 不含硫酸)	DCD0529A	100ml