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蛋白磷酸化研究的预制胶 SuperSep Phos-tag(TM)

来源：作者：人气：-发表时间：2025-04-29 14:31:00【大中小】

蛋白磷酸化研究的预制胶

SuperSep Phos-tag™

SuperSep Phos-tag™ 是研究蛋白磷酸化的方法，无需特异性磷酸化抗体或者同位素标记。

◆SuperSep Phos-tag™

Phos-tag™ 是一种预制胶，预先加入了 50 μmol/L 的 Phostag™ Acrylamide，打开包装即可直接使用。预制胶中含有锌作为金属离子，在中心凝胶缓冲液中保存稳定性很好，得到的带条结果也很整齐。

磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白作为不同条带分离。

分离后，胶可用于考马斯亮蓝染色，免疫印迹和质谱实验。

◆Phos-tag™ SDS-PAGE 的原理

◆在 HighWire Search 上搜索到的论文数

◆运用

利用 p35 的丙氨酸突变体确定 Cdk5 激活 p35 的磷酸化位点

p35 常见的磷酸化位点是 Ser8 和 Thr138。但是 Ser8 和 Thr138 位点往往会发生丙氨酸突变，产生３种突变体（Ser8 突变体：S8A，Thr138 突变体：T138A，Ser8 和 Thr138 双突变体：2A）。这３种突变体、野生型 p35、Cdk5 和没有激酶活性的 Cdk5 都来源于 COS-7 细胞。这些细胞裂解液用Phos-tag™ SDS-PAGE 和 Western blotting 进行检测（检测抗体：p35 抗体）。

100 μM Phos-tag ™ 丙烯酰胺, 7.5% 聚丙烯酰胺凝胶

- 泳道１（条带 L2 和 L4）和泳道５（条带 M1）：p35 在 Cdk5 的作用下发生了磷酸化；

- 泳道１（条带 L2 和 L4）和泳道３（条带 L2 和 L4）：在无激酶活性 Cdk5 的作用下，大约有一半 p35 蛋白在 Thr138 位点发生磷酸化，同样在 138 位发生突变的 p35 蛋白亦是如此。

- 泳道５（条带 M1）和泳道６（条带 L3 和 L4）：Ser8 和 Thr138 是主要的磷酸化位点；

- 泳道５（条带 M1）、泳道７（条带L1和L2）和泳道８（条带M2）：条带 M1 是 Ser8 和T hr138 都发生磷酸化的条带；

条带 M2 是只有 Ser8 磷酸化的条带；条带 L1 和 L2 是只有 Thr138 磷酸化的条带。

※ 条带 L1 和 L3 中的Ｘ是不确定哪个位点发生磷酸化的条带；

※ 条带L4是非磷酸化的 p35 。

可明确磷酸化位点和条带迁移率的关系！

【参考文献】

? Quantitative Measurement of in Vivo Phosphorylation States of Cdk5 Activator p35 by Phos-tag ™ SDS-PAGE. T. Hosokawa, T. Saito, A. Asada, K. Fukunaga, and S. Hisanaga,Mol. Cell. Proteomics, Jun 2010;9: 1133 - 1143.

【结果提供】

理化学研究所脑科学综合研究中心回路功能研究核心记忆功能研究团队细川智永（Dr. T. Hosokawa）

首都大学东京理工学研究科生命科学专业神经分子功能研究室久永真市（Dr. S. Hisanaga）

检测含有 Dnmt1 磷酸化激酶的片段

① 采用亲和色谱法从鼠脑提取液中纯化 GST-Dnmt1（1-290）结合蛋白

② 使用 0.3 M 和 1 M NaCl 的 DNA 纤维素柱洗脱得到目的蛋白

③ GST-Dnmt1（1-290）作为体外激酶实验的反应底物

④ Phos-tag ™ SDS-PAGE 用于Western blotting，确定迁移条带中每个片段的激酶活性

可确定在片段中含有目的激酶！

【参考文献】

The DNA-binding activity of mouse DNA methyltransferase 1 is regulated by phosphorylation with casein kinase 1delta/epsilon. Y. Sugiyama, N. Hatano, N. Sueyoshi, I. Suetake, S. Tajima, E. Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, T. Koike, and I. Kameshita, Biochem. J., May 2010; 427(3): 489-97.

【结果提供】

高知大学综合研究中心生命、功能物质部门实验实习机器设施杉山康宪（Dr. Y. Sugiyama）

香川大学农学部应用生物科学科动物功能生化学研究室龟下勇（Dr. I. Kameshita）

二维电泳中的应用：分析 hnRNP K 磷酸化异构体

小鼠巨噬细胞 J774.1 经 LPS 刺激后，裂解细胞，经过免疫沉淀法分离得到 hnRNP K。在二维电泳中，一维是 IPG 胶，二维是 Phos-tag ™ SDS-PAGE，可分离 hnRNP K 的异构体。利用质谱仪，可以确认不同的点代表不同的亚型或修饰蛋白。

同一个等电点的位置上，不同位点发生磷酸化都可以被区分开来

（例: spots 6 vs. 8 and spots 4 vs. 7）

【参考文献】

? Characterization of multiple alternative forms of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K by phosphate-affinity electrophoresis. Y. Kimura, K. Nagata, N Suzuki, R. Yokoyama, Y. Yamanaka, H. Kitamura, H. Hirano, and O. Ohara, Proteomics, Nov 2010; 10(21): 3884-95.

【结果提供】

横滨市立大学生命纳米系统科学研究科生物体超分子系统科学专业木村弥生（Dr. Y. Kimura）、平野久（Dr. H. Hirano）

理化学研究所 RCAI 小原收

◆备注

样品制备：

Phos-tag SDS-PAGE 对于蛋白样品中的杂质非常敏感，尤其是螯合剂，钒酸，无机盐，表面活性剂这类物质。

强烈建议在 Phos-tag SDS-PAGE 之前通过 TCA 沉淀或渗析法降低杂质含量。

转膜前处理：

另一个必须的步骤是在转膜前，用 EDTA 去除凝胶中的金属离子（Mn²⁺或者Zn²⁺）；该步骤可提高蛋白的转膜效率。

●　分别准备 10 mmol/L 含 EDTA 和不含 EDTA 两种 1x transfer buffer。

●　将凝胶浸泡在含 10 mmol/L EDTA 的 1x transfer buffer，至少 20 分钟，温和摇晃。更换新缓冲液，重复３次。

●　将凝胶浸泡在不含 10 mmol/L EDTA 的 1x transfer buffer，10 分钟，温和摇晃。

●　转膜操作*。

* 建议用湿法转膜，以提高转膜效率。

◆质量控制

每一批 SuperSep Phos-tag™，出厂前均根据其产品规格进行测试，以保证可分离磷酸化和非磷酸化蛋白，以及他们的分离成都在正常参数内。

◆保存温度

2-10℃

产品列表

用于 Wako EasySeparator 电泳仪

产品编号	产品名称	产品规格
193-16711	SuperSep Phos-tag™ (50 μmol/L), 10%, 13 well Phos-tag 13孔10%预制胶	5块
190-16721	SuperSep Phos-tag™ (50 μmol/L), 10%, 17 well Phos-tag 17孔10%预制胶	5块
195-16391	SuperSep Phos-tag™ (50 μmol/L), 12.5%, 13 well Phos-tag 13孔12.5%预制胶	5块
193-16571	SuperSep Phos-tag™ (50 μmol/L), 12.5%, 17 well Phos-tag 17孔12.5%预制胶	5块
193-16691	SuperSep Phos-tag™ (50 μmol/L), 15%, 13 well Phos-tag 13孔15%预制胶	5块
196-16701	SuperSep Phos-tag™ (50 μmol/L), 15%, 17 well Phos-tag 17孔15%预制胶	5块
192-17381	SuperSepTM Phos-tagTM (50μmol/L), 7.5%, 17well Phos-tag™ 预制胶50μmol/l，7.5%，17孔	5块
195-17371	SuperSepTM Phos-tagTM (50μmol/L), 7.5%, 13well Phos-tag™ 预制胶50μmol/l，7.5%，13孔	5块
199-17391	SuperSepTM Phos-tagTM (50μmol/L), 6%, 17well Phos-tag™ 预制胶50μmol/l，6%，17孔	5块
192-17401	SuperSepTM Phos-tagTM (50μmol/L), 6%, 13well Phos-tag™ 预制胶50μmol/l，6%，13孔	5块

用于 Bio-Rad 伯乐电泳仪

产品编号	产品名称	产品规格
198-17981	SuperSep™ Phos-tag™ (50μmol/L), 7.5%, 17well, 83×100×3.9mm	5 块
195-17991	SuperSep™ Phos-tag™ (50μmol/L), 12.5%, 17well, 83×100×3.9mm	5 块

用于 Life Technologies 电泳仪

产品编号	产品名称	产品规格
192-18001	SuperSep™ Phos-tag™ (50μmol/L), 7.5%, 17well, 100×100×6.6mm	5 块
199-18011	SuperSep™ Phos-tag™ (50μmol/L), 12.5%, 17well, 100×100×6.6mm	5 块