总及游离三碘甲状腺原氨酸（TT3及FT3）-磁微粒化学发光法（AE/AP）/荧光免疫层析解决方案（双抗体夹心法）

来源：作者：人气：-发表时间：2025-01-22 13:31:00【大中小】

1.项目背景

1.1临床意义

摘自《总三碘甲状腺原氨酸检测试剂注册技术审查指导原则》

三碘甲状腺原氨酸（3,5,3’-L-三碘甲状腺原氨酸，T3）是由甲状腺合成和分泌（占大约20%）或由甲状腺素在5’位脱碘转化而来（占大约80%）的一种激素，分子量为651Da，是目前已知生物活性最强的甲状腺激素，其生物活性为甲状腺素（T4）的3～5倍。在血液循环中，99.7%的T3与结合蛋白结合，发挥生理活性的是游离的T3（FT3）。游离T3检测对疾病诊断的灵敏度和特异性较好，但相对总T3而言更容易受到一些疾病和药物的干扰导致结果假性偏高或偏低，此时总T3检测结果更能准确反映体内三碘甲状腺原氨酸的状态。总三碘甲状腺原氨酸（TT3）是指血清或血浆中游离态和结合态三碘甲状腺原氨酸的总和，在临床上主要用于辅助诊断甲状腺功能亢进症（简称甲亢）、甲状腺功能减低症（简称甲减）及其临床疗效的评价等。

TT3在正常和病理状态下的水平特点，不同类型疾病、不同人群（例如年龄、性别、妊娠情况等）的TT3水平差异。详细说明测定TT3水平对相关疾病的临床指导意义。

TT3升高见于：

①甲亢，包括原发性/继发性甲亢、T3型甲亢；

②亚急性甲状腺炎和无痛性甲状腺炎；

③促甲状腺激素（TSH）不适当分泌综合征。

TT3降低见于：

①甲减；

②甲状腺切除术后；

③应用雄激素、糖皮质激素、生长激素等药物引起TBG降低。

FT3的检测理论上不受结合蛋白浓度和结合力特性的影响，因此不需要额外进行反映结合参数类项目的检测(如T-uptake，TBG)。因此，FT3的测定是临床常规评估甲状腺功能的重要指标。FT3的测量结果可作为甲状腺疾病鉴别诊断的依据，被用来区分不同类型的甲亢，以及确诊T3甲状腺毒症。

1.2小分子双抗体夹心法

2024年公开专利CN117871874A《小分子物质免疫检测方法》对小分子夹心法的反应原理做了详细阐述，摘抄部分内容如下。

本发明提出了一种小分子物质免疫检测方法，其特征在于，包括：（1）将含有小分子物质的样本、配体、第二抗体和表面活性剂进行反应，得到小分子物质-配体-第二抗体三元复合物，且所述小分子物质-配体-第二抗体三元复合物中小分子物质诱导配体形成至少一个新的构象表位，所述第二抗体可特异性结合所述至少一个新的构象表位，所述表面活性剂可消除所述第二抗体与构象未改变的配体之间的结合；（2）检测所述小分子物质-配体-第二抗体三元复合物。

样本中的小分子物质与配体发生特异性结合，得到小分子物质-配体复合物，并且小分子物质-配体复合物中小分子物质诱导配体形成至少一个新的构象表位。小分子物质-配体复合物与第二抗体和表面活性剂反应，第二抗体特异性地与形成新构象表位的配体结合，同时也会与构象未改变的配体产生弱结合。表面活性剂可消除第二抗体与构象未改变的配体之间的结合，得到小分子物质-配体-第二抗体三元复合物。通过检测三元复合物，可以实现小分子物质检测。由此，采用双抗体夹心法可以提高检测准确性和灵敏度，不同浓度梯度样本检测区分度高。同时，减少了筛选高特异性复合物抗体的难度，更有利于小分子物质检测试剂盒的大规模生产和检测，应用价值高。

2. 性能表现

针对TT3/FT3的检测（夹心法），西宝生物推出3种抗体及2种解离剂。

具体性能如下（以下评估仅代表在西宝生物的工艺体系下的验证，建议客户根据自身工艺进行更为详细的验证）。

2.1化学发光（AE）平台

组合1（TT3）：T3抗体（货号：EKY0323G）包被羧基磁珠+T3复合物抗体（货号：EKY0323H）标记吖啶酯+TT3解离剂（发光专用）（货号：DCH0208A）；

线性范围：0.195ng/mL-6.51ng/mL；最低检出限：0.195ng/mL。

组合1（FT3）：T3抗体（货号：EKY0323F）包被羧基磁珠+T3复合物抗体（货号：EKY0323H）标记吖啶酯；

线性范围：0.26pg/mL-32.55pg/mL；最低检出限：0.26pg/mL。

2.2化学发光（AP）平台

组合2（TT3）：T3抗体（货号：EKY0323G）包被羧基磁珠+T3复合物抗体（货号：EKY0323H）标记碱性磷酸酶+TT3解离剂（发光专用）（货号：DCH0208A）；

线性范围：0.195ng/mL-6.51ng/mL；最低检出限：0.195ng/mL。

组合2（FT3）：T3抗体（货号：EKY0323F）包被羧基磁珠+T3复合物抗体（货号：EKY0323H）标记碱性磷酸酶；

线性范围：0.26pg/mL-32.55pg/mL；最低检出限：0.26pg/mL。

2.3荧光免疫层析平台

组合3（TT3）：T3抗体（货号：EKY0323G）标记荧光微球+T3复合物抗体（货号：EKY0323H）划膜+TT3解离剂（层析专用）（货号：DCH0208B）；

线性范围：0.50ng/mL-6.51ng/mL；最低检出限：0.50ng/mL。

组合3（FT3）：T3抗体（货号：EKY0323G）标记荧光微球+T3复合物抗体（货号：EKY0323H）划膜；

线性范围：1pg/mL-32.55pg/mL；最低检出限：1pg/mL。

3.临床相关性

3.1化学发光（AE）平台：

3.1.1 西宝生物发光（AE）平台TT3抗体配对组合1与罗氏诊断的TT3试剂（电化学发光法）赋值的临床样本相关性R²＞0.90，相关性较好；

3.1.2西宝生物发光（AE）平台FT3抗体配对组合1与罗氏诊断的FT3试剂（电化学发光法）赋值的临床样本相关性R²＞0.95左右，相关性良好。

3.2化学发光（AP）平台：

3.2.1西宝生物发光（AP）平台TT3抗体配对组合2与罗氏诊断的TT3试剂（电化学发光法）赋值的临床样本相关性R²＞0.90左右，相关性较好；

3.2.2西宝生物发光（AP）平台FT3抗体配对组合2与罗氏诊断的FT3试剂（电化学发光法）赋值的临床样本相关性R²＞0.95，相关性良好。

3.3荧光免疫层析平台：

3.3.1 西宝生物荧光免疫层析平台TT3抗体配对组合3与罗氏诊断的TT3试剂（电化学发光法）赋值的临床样本相关性R²＞0.95，相关性良好。

3.3.2 西宝生物荧光免疫层析平台FT3抗体配对组合3与罗氏诊断的FT3试剂（电化学发光法）赋值的临床样本相关性R²＞0.95，相关性良好。

4. 测试方案

4.1化学发光（AE）平台

4.1.1 TT3抗体配对组合1

样本:样品加样量20ul；

试剂1：T3抗体（货号：EKY0323G）包被-磁珠稀释物，用量50ul/测试；

试剂2：T3复合物抗体（货号：EKY0323H）标记-吖啶酯稀释物，用量50ul/测试；

试剂3：TT3解离剂（发光专用）（货号：DCH0208A）。

反应条件：

第一步：20ul样本+50ul试剂1+50ul试剂3，37℃孵育10min，清洗；

第二步：加入50ul 试剂2，37℃孵育10min，清洗；

第三步：加入预激发液及激发液，进行测试。

4.1.2 FT3抗体配对组合1

样本:样品加样量20ul；

试剂1：T3抗体（货号：EKY0323F）包被-磁珠稀释物，用量50ul/测试；

试剂2：T3复合物抗体（货号：EKY0323H）标记-吖啶酯稀释物，用量50ul/测试；

反应条件：

第一步：20ul样本+50ul试剂1，37℃孵育10min，清洗；

第二步：加入20ul 试剂2，37℃孵育10min，清洗；

第三步：加入预激发液及激发液，进行测试。

测试使用发光仪器:科斯迈SMART 500S。

4.2化学发光（AP）平台

4.2.1 TT3抗体配对组合2：

样本:样品加样量10ul；

试剂1：T3抗体（货号：EKY0323G）包被-磁珠稀释物，用量50ul/测试；

试剂2：T3单复合物抗体（货号：EKY0323H）标记-碱性磷酸酶稀释物，用量50ul/测试；

试剂3：TT3解离剂（发光专用）（货号：DCH0208A）。

反应条件：

第一步：10ul样本+50ul试剂1+50ul试剂3混合，37℃孵育10min，清洗；

第二步：加入50ul 试剂2，37℃孵育10min，清洗；

第三步：加入底物，进行测试。

4.2.2 FT3抗体配对组合2：

样本:样品加样量20ul；

试剂1：T3抗体（货号：EKY0323F）包被-磁珠稀释物，用量50ul/测试；

试剂2：T3复合物抗体（货号：EKY0323H）标记-碱性磷酸酶稀释物，用量50ul/测试；

试剂3：TT3解离剂（发光专用）（货号：DCH0208A）。

反应条件：

第一步：20ul样本+50ul试剂1+50ul试剂2混合，37℃孵育10min，清洗；

第二步：加入底物，进行测试。

测试使用发光仪器:迎凯Shine i2900。

4.3荧光免疫层析平台

4.3.1 TT3抗体配对组合3

反应条件：10ul样品+100ul TT3解离剂（层析专用）（货号：DCH0208B）混匀（无需等待解离），上样，反应时间（10min-15min）；

4.3.2 FT3抗体配对组合3

反应条件：10ul样品+100ul 稀释液混匀，上样，反应时间（10min-15min）；

测试使用荧光仪器:和迈FIC-S100。

5.产品信息

产品名称	货号	推荐配对
三碘甲状腺原氨酸（T3）抗体	EKY0323F	TT3配对： T3抗体（货号：EKY0323G）包被羧基磁珠+T3复合物抗体（货号：EKY0323H）标记吖啶酯+TT3解离剂（发光专用）（货号：（货号：DCH0208A））（发光配对组合1） T3抗体（货号：EKY0323G）包被羧基磁珠+T3单抗3（货号：EKY0323H）标记碱性磷酸酶+TT3解离剂（发光专用）货号：DCH0208A）（发光配对组合2） T3抗体（货号：EKY0323G）标记荧光微球+T3复合物抗体（货号：EKY0323H）划膜+TT3解离剂（层析专用）（荧光配对组合3） FT3配对： T3抗体（货号：EKY0323F）包被羧基磁珠+T3复合物抗体（货号：EKY0323H）标记吖啶酯（发光配对组合1） T3抗体（货号：EKY0323F）包被羧基磁珠+T3复合物抗体（货号：EKY0323H）标记碱性磷酸酶（发光配对组合2） T3抗体（货号：EKY0323G）标记荧光微球+T3复合物抗体（货号：EKY0323H）划膜（荧光配对组合3）
三碘甲状腺原氨酸（T3）抗体	EKY0323G
三碘甲状腺原氨酸（T3）复合物抗体	EKY0323H
三碘甲状腺原氨酸（T3）校准质控物	DBY0185D
T3抗体（货号：EKY0323F）包被羧基磁珠浓缩液	DKY1337A
T3抗体（货号：EKY0323G）包被羧基磁珠浓缩液	DKY1337B
T3复合物抗体（货号：EKY0323H）吖啶酯浓缩液	DKY1337C
T3复合物抗体（货号：EKY0323H）标记碱性磷酸酶浓缩液	DKY1337D
T3抗体（货号：EKY0323G）标记荧光微球浓缩液	DKY1337E
AMPPD 发光底物液（即用型）	DCD0517A
AMPPD 发光底物液（即用型）	DCD0517B
羧基磁性微球，1.5um	DEG0800C
时间分辨荧光微球，羧基（200nm）	AEG0786B
TT3解离剂（发光专用）	DCH0208A
TT3解离剂（层析专用）	DCH0208B
牛血清白蛋白(无蛋白酶,低脂肪酸,低lgG,内毒素)	DCL0001T	磁珠浓缩液、吖啶酯浓缩液、碱性磷酸酶浓缩液的稀释液中及包被及标记种封闭剂含有此款BSA可有效降低背景信号值及提高信噪比。建议使用浓度1%-2%。
酶解深水鱼皮明胶	ACH0085J	样品垫、释放垫、标记过程中封闭剂或稳定剂。建议使用浓度1%-10%。
蛋白保护剂GH	DCL0009A	推荐使用浓度20%左右。