mRNA疫苗技术解析-关键性原料为开发保驾护航

来源：作者：人气：-发表时间：2021-08-20 13:16:00【大中小】

mRNA疫苗是一种核酸疫苗，将在体外合成的编码特定抗原的mRNA序列导入至体内，并表达为相应的抗原蛋白，通过诱导免疫系统针对此抗原蛋白的免疫应答反应，从而达到预防疾病的目的。mRNA疫苗现在主要用来防治多种感染性疾病，如RNA病毒感染性疾病和DNA病毒感染性疾病等。

1、RNA病毒感染性疾病：mRNA疫苗可用于传染性强、危害性大的RNA病毒感染性疾病的预防，如新冠病毒感染，可在预防新冠病毒感染方面起到重要作用。

2、DNA病毒感染性疾病：mRNA疫苗可用于巨细胞病毒等DNA病毒感染性疾病的预防。

另外，mRNA疫苗还可用于链球菌和结核杆菌等细菌感染性疾病。mRNA疫苗具有高效、安全、成本较低等优点，但在身体中的表达不够稳定，可能会引起一些局部反应或全身反应等副作用，建议患者在医生指导下进行接种，避免出现不必要的危害。

mRNA疫苗究竟是什么

为什么它们在对抗冠状病毒方面会大有可为？

图片来源于网络 http://www.seebio.cn/product.php?id=2510

mRNA疫苗诊治(见上图),是指在体外合成mRNA，将其导入体内，mRNA进入细胞后翻译表达出抗原蛋白，抗原刺激体内免疫系统，激活体液免疫和细胞免疫，当机体再次接触同种抗原(细胞/病毒)，可产生快速免疫应答反应，自我保护。与传统的“灭活”;疫苗(引入削弱或灭活的病毒)不同，mRNA疫苗会教细胞制造一种刺激免疫反应的蛋白质，训练免疫系统如何处理冠状病毒Sars-Cov-2。

mRNA技术的应用：

全球累计有超过150种mRNA药及疫苗研究路线，主要是针对传染病，肿瘤疾病，蛋白质替代和基因诊治层面，目前大多数的项目研究还处于早期阶段，新冠疫情的爆发，加快了mRNA疫苗的研发上市。

mRNA疫苗生产工艺流程(来源于网络)

mRNA疫苗优势：

mRNA疫苗具备安全性高、批次间差异小，具有响应迅速、廉价量产的优势，因此能大幅节省时间成本及研发、生产费用，但mRNA疫苗对于存储条件要求高，需保存在超低温环境。与传统疫苗相比

mRNA疫苗具备以下优势：

1)抗原选择范围广；
2)具备自我佐剂特点，表现更强的免疫原性；
3)具备足够的安全性。与质粒DNA疫苗相比，mRNA疫苗没有导入外源基因的遗传风险，不进入细胞核内部，只在细胞质内表达抗原，起效更快，效果更强。
4)存在多种修饰方法，能够使mRNA疫苗更加稳定，翻译效率更高，同时纳米脂质体递送方式的发展能够使 mRNA 疫苗快速递送到细胞内从而发挥功能。
5)不依赖细胞培养技术，可快速构建疫苗。现在的体外转录技术能够很快速、廉价地大规模生产 RNA 疫苗，相较于传统活疫苗 5-6个月的生产周期，mRNA疫苗只要有了病毒的基因序列，有望在40天内完成疫苗样品的生产制备。因此有望更好的应对突发的传染病疫情。
6)生物化学合成，生产过程无病毒感染风险。

图片来源于网络

疫苗种类	安全性	预防效果	抗体特异性	制备工艺	GMP要求	研发周期	生产周期	储存条件	成本	是否能共享生产线
灭活与减毒疫苗	低	高	低	严重依赖佐剂	高	8年以上	5-6个月	2-8℃	低	否
亚单位疫苗	高	中	高	严重依赖佐剂	高	8年以上	5-6个月	2-8℃	低	否
腺病毒载体疫苗	中	低	低	佐剂依赖型弱	高	3-5年	约40天	2-8℃	中	可以
mRNA疫苗	高	高	高	不依赖	低	3-5年	约40天	-20℃至-70℃	低	可以

mRNA疫苗开发流程包括病原体识别、测序、mRNA体外合成和修饰、纯化等操作。mRNA疫苗的研究制备需要多种原料来保障疫苗的成功开发。高产量的mRNA需要mRNA体外合成方法，大规模生产选择T7 RNA聚合酶体外转录。增强mRNA的稳定性，降低免疫原性并提升翻译效率，解决方案是：使用加帽酶对mRNA进行加帽，使其在细胞内外稳定，降低免疫原性，并且使mRNA可以被核糖体识别，启动翻译程序。西宝生物作为国内IVD诊断原料综合供应商，通过分子酶技术平台、大规模蛋白发酵纯化技术平台，目前已成功开发各类分子酶相关原料产品。我们可提供一系列mRNA体外合成酶及试剂，解决mRNA疫苗研发生产的关键性原料问题，所有产品均采用药用规格原辅料生产，严格控制宿主蛋白质残留、核酸残留及常见病原体污染，符合GMP规范的产品生产与质量管理规程，保障生产过程及所有原辅料可追溯。咨询订购可拨打400-021-8158

mRNA疫苗体外合成关键步骤及相关产品：

1．生成模板-质粒线性化

相关产品：BsaI限制性内切酶(货号：EAE0035A)

限制性内切酶Bsa I特异性识别双链DNA中位点并进行酶切，可将模板质粒酶切线性化，作为mRNA体外合成模板；

产品特点：

特异性强
受CpG、Dcm甲基化影响，剪切阻断
受EcoBI甲基化影响，剪切可能受影响
不受Dam甲基化影响

2．mRNA体外合成此步以DNA为模板，在体外由RNA聚合酶催化合成mRNA。

相关产品：Seebio® T7 RNA Polymerase,T7 RNA聚合酶 (货号：EAE0006C)

T7 RNA聚合酶是体外转录mRNA的关键酶，T7 RNA Polymerase(T7 RNA聚合酶)是高度特异识别T7启动子序列的5'→3' RNA聚合酶，以含有T7启动子序列的单链或双链DNA为模板，以NTP为底物，合成与启动子下游的单链DNA互补的RNA。

产品特点：

高度特异识别T7启动子
5’→3’ RNA聚合酶活性
可用于标记或非标记RNA的合成
可接受生物素、地高辛、荧光蛋白标记的核苷酸作为底物用于RNA的合成
?体外转录产生的mRNA，纯度高，均一性好。

3．mRNA转录后修饰：加帽加尾，对mRNA进行修饰，合成功能完整的mRNA。

由于RNA的稳定性较弱，因此合成后的mRNA稳定性是必须要关注的问题。通常需要通过在5'端加上帽子结构(Cap1)和3'端加ployA尾加强mRNA的稳定性。西宝提供低残留mRNA加帽的Vaccinia Capping Enzyme(牛痘病毒加帽酶)是经过GMP工艺要求生产获得，满足疫苗生产所需。

可用于给体外转录合成的mRNA催化加上帽子结构(Cap0)，显著改善mRNA的稳定性和翻译能力，使mRNA可在细胞内表达蛋白，避免核酸外切酶等的降解破坏。进一步形成cap-1结构需要2-O甲基转移酶(Cat.No:EAE0033B, Seebio)参与，该修饰可以降低RNA在体内引起的细胞先天免疫反应。

3.1 mRNA加帽(Cap0)

相关产品：Vaccinia Capping Enzyme, GMP Grade (货号：EAE0033A)

作用：与3.2mRNA加帽(Cap1)同时进行，在mRNA的5'端加上Cap0帽结构。

产品特点：

完成mRNA加帽Cap0
提高mRNA的稳定性，防止被RNA酶降解
提高mRNA的翻译效率，提高蛋白产量

3.2 mRNA加帽(Cap1)

作用：与3.1产品 mRNA加帽(Cap0) 同时进行，在mRNA的5'端加上Cap0帽结构的基础上，再将Cap0转化为Cap1结构。

相关产品：mRNA 2'-O-Methyltransferase, GMP Grade(货号：EAE0033B)

mRNA Cap 2'-O-Methyltransferas (2'-O-甲基转移酶)可利用S-腺苷甲硫氨酸(SAM)作为甲基供体，在 RNA 5'末端紧邻帽结构(Cap0)的第一个核苷酸的 2'-O 上添加甲基基团，形成带有Cap1结构的mRNA。Cap1 结构能增强mRNA的翻译效率，从而可提高转染后 mRNA 编码的蛋白表达水平。该酶需要有m7GpppN即7-甲基鸟苷帽结构的RNA作为底物，不会作用于5'末端为pN、ppN、pppN或GpppN的RNA。带7-甲基鸟苷帽结构(m7GpppN)的RNA可通过Vaccinia Capping System(货号：EAE0033A)来制备。

产品特点：

使mRNA的Cap 0帽子甲基化为Cap1帽子
提高RNA的翻译效率，提高蛋白产量
进一步降低免疫原性

产品质量：

生产工艺	GMP工艺生产
残留	无核酸酶、内毒素含量低
来源	大肠杆菌重组表达
纯度高	>95%
纯度检测方法	(SDS-PAGE)电泳
比活	~160U/mg(BCA)

残留检测：分别检测Rnase、核酸酶、切口酶、大肠杆菌DNA残留，经检测结果显示，成品无相关酶的残留，且表达的宿主DNA残留也达到了要求标准。

3.3、mRNA加尾(PolyA) ，作用在mRNA的3'端加上PolyA尾。

相关产品：E. coli Poly(A) Polymerase, GMP Grade (货号：ECE0567B)

体外转录RNA过程中，E.coli Poly(A) Polymerase(加尾酶)不依赖模板的存在，可以催化ATP以AMP的形式依次掺入到RNA的3'末端，即在RNA的3'末端加多聚A尾。Poly(A)聚合酶具有很高的加尾效率，可以在RNA的3'末端加入20~200个A碱基。很大程度还原体内加尾过程。

产品特点：

稳定mRNA的存在形式
引导转录终止
提高RNA在真核细胞中的翻译效率

mRNA疫苗研发生产还有一个很关键的步骤那就是递送系统

保护mRNA，帮助它们进入人体细胞，然后又协助它们指导细胞生成病毒蛋白的“好帮手”--脂质纳米颗粒。可以说，没有它就没有现在的mRNA新冠疫苗。

递送技术平台是mRNA疫苗的关键之一，已经有大量的mRNA制剂系统见诸报道，其中的很多已经进入临床试验阶段。这些制剂技术都是通过形成特殊的mRNA载体，来实现mRNA疫苗的递送，这些载体技术包括：鱼精蛋白载体技术、纳米颗粒脂质体载体技术、多聚体载体技术。

早期使用的脂质体递送材料是阳离子脂质体。带正电荷的阳离子脂质体与带负电荷的mRNA通过经静电作用聚集形成多层囊状复合物，称为脂质体复合物，复合物中包封的mRNA不易被RNase降解，能被成功递送至细胞翻译成功能性蛋白。2-二油酰基羟丙基-3-N，N，N-三甲铵氯(DOTAP)和二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)是已被证实递送载体。阳离子聚合物具有浓缩 mRNA 的作用，mRNA与聚合物浓缩后被阳离子脂质体包裹在囊状空腔中则形成脂质体聚合物(lipopolyplex，LPR)。LPR早期用于DNA转染，后来也用于siRNA和mRNA转染。

脂质体纳米粒LN--将mRNA送进细胞的载体

一般由被脂质双层壳包围的水性核心组成，脂质双层壳由不同的脂质组成，每种脂质都发挥着不同的功能。LNP 是目前主流的递送载体之一。由于其比较容易被抗原呈递细胞吸收，在保护mRNA并将其运输到细胞当中发挥着举足轻重的作用。目前三大mRNA疫苗巨头企业，Moderna、CureVac和BioNTech均采用了LNP递送技术。

纳米颗粒脂质体(Lipid nanoparticles，LNPs)即LNPs 递送系统详情介绍可参阅《没有脂质体，就没有新冠mRNA疫苗 - 记新型纳米结构脂质体在mRNA疫苗中的应用》

西宝生物作为一家综合性的服务商，可提供mRNA疫苗研究生产用原料，具体产品订购详情如下(400-021-8158)：

产品类别	产品用途	订购货号	产品名称	规格
mRNA疫苗工具酶
限制性内切酶Bsa I	特异性识别双链DNA中位点并进行酶切	EAE0035A	BsaI限制性内切酶	1Ku
加帽酶(RNA加帽)	mRNA的5'端加上Cap0帽结构	EAE0033A	Vaccinia Capping System 牛痘病毒加帽酶	100U
加帽酶(RNA加帽)	mRNA的5'端加上Cap0帽结构	EAE0033A	Vaccinia Capping System 牛痘病毒加帽酶	500U
加帽酶(cap1)	将Cap0转化为Cap1结构	EAE0033B	mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase, GMP Grade mRNA Cap-2'-O-甲基转移酶	1Ku,10Ku
加尾酶	在mRNA的3'端加上PolyA尾，l提高RNA在真核细胞中的翻译效率	ECE0567B	加尾酶	100U,500U
T7 RNA聚合酶	T7 RNA聚合酶是体外转录mRNA的关键酶	EAE0006C	T7 RNA Polymerase T7 RNA聚合酶	2Ku,10Ku,100Ku
RNA酶抑制剂	mRNA合成与修饰中加入RNase Inhibitor，防止RNA降解。RNase Inhibitor可与RNase A形成1：1复合体，对RNase 有极强非竞争性抑制，保护mRNA转录后不被降解	EAE0004F	RNase Inhibitor, GMP Grade RNA酶抑制剂	10KU
脱氧核糖核酸酶I	合成后的产物可能会有DNA残留，在疫苗开发阶段，残留的去除是关键的步骤，以减少下游纯化难度并增加产品的纯度。	ECE0200E	DNase I, GMP Grade 脱氧核糖核酸酶I	100U,1KU,5Ku
无机焦磷酸酶	RNA合成过程中加入无机焦磷酸酶，去除mRNA合成过程中产生的焦磷酸，提高mRNA产量增加RNA产量。	EAE0034C	Pyrophosphatase,Inorganic GMP-grade 耐热无机焦磷酸酶	10U
纳米颗粒脂质体载体
DMG-PEG2	PEG化脂质，减少粒子在体内与血浆蛋白的结合，延长体循环时间，用于mRNA疫苗和药载体。	ECS2196A	DMG-PEG2 二肉豆蔻酰甘油-聚乙二醇2	1g
ALC-0159	PEG化脂质，减少粒子在体内与血浆蛋白的结合，延长体循环时间。用于mRNA疫苗和药。	ECS2195A	ALC-0159 甲氧基聚乙二醇双十四烷基乙酰胺	1g
SM-102	阳离子脂质体，mRNA疫苗和药进入细胞的载体，包载核酸药，提供正电荷，与带负电荷的遗传物质复合，有助于内涵体逃逸。	ECS2194A	SM-102 十七烷-9-基-8-((2-羟乙基)(6-氧代-6-((癸氧基)己基)氨基)辛酸酯)	1g
ALC-0315	包载核酸药，提供正电荷，与带负电荷的遗传物质复合，有助于内涵体逃逸，体内转染，用于mRNA疫苗和药载体。	ECS2193A	ALC-0315 ((4-羟基丁基)氮杂二烷基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)	1g
胆固醇	胆固醇，介导LNP内吞，稳定LNP结构	AJA0003L	胆固醇	25g
二硬脂酰基磷脂酰胆碱	磷脂酰胆碱，辅助型脂质，可以在内吞时加快mRNA的释放	EGZ0338C	DSPC 二硬脂酰基磷脂酰胆碱	1g
聚乙二醇化磷脂	聚乙二醇化磷脂，延长代谢时间，LNP提高稳定性	ECS2002A	MPEG-DSPE, Mw 5K 聚乙二醇化磷脂	1g
聚乙二醇化磷脂	聚乙二醇化磷脂，延长代谢时间，LNP提高稳定性	ECS4401A	MPEG-DSPE, Mw 350 聚乙二醇化磷脂	1g
聚乙二醇化磷脂	聚乙二醇化磷脂，延长代谢时间，LNP提高稳定性	ECS2012A	MPEG-DSPE, Mw 2K 聚乙二醇化磷脂	1g，10g
mRNA体内递送聚合物材料
线性聚乙烯亚胺	mRNA疫苗递送系统用的阳离子聚合物，可适用于多种细胞系转染	AJL0940B	线性聚乙烯亚胺（PEI 40,000）	10mg,100mg,1g