近日，中科院南海海洋所张长生团队与中国海洋大学朱伟明教授、加拿大拉瓦尔大学Rong Shi教授、中科院广州生物医药与健康研究院刘劲松研究员经过多年合作研究，详细解析了免疫抑制剂浅蓝霉素A的生物合成途径，揭示了浅蓝霉素生物合成中独特的“底物回补”机制，为次级代谢产物基因簇中未知功能基因的研究提供了新思路，相关成果在Chemcial Science （2016, DOI: 10.1039/C6SC00771F）和ACS Chemical Biology（2016, 11, 943-952）等期刊上发表。

“补救”（salvage）或“回补”（recycling） 途径是生物初级代谢中常见现象，涉及到核苷酸、辅酶、四氢喋呤、氨基酸、维生素和鞘脂等分子的生物合成。“补救”途径是生物体为了适应生存需要，将已分解 的部分代谢产物加以再次利用，派生出支路合成途径以合成生物体所需的生物分子，是对“从头合成”的一种有效补充。但“补救”或“回补”途径在次级代谢生物 合成过程中非常罕见。

浅蓝霉素（CRMs）是一系列含有独特二联吡啶环结构的化合物，主要由海洋放线菌Actinoalloteichus cyanogriseus WH1-2216-6产生，具有抗菌和抗肿瘤等生物活性，其中浅蓝霉素A（CRM A）具有良好的免疫抑制活性，其免疫抑制活性10倍优于临床药物环孢霉素A。因此，CRM A正被美国的Nostrum制药公司作为新型免疫抑制剂的药物先导进行临床研发。

阐明CRM A的生物合成途径是将组合生物合成技术应用于CRM A结构改造和产量优化的前提。研究人员从海洋放线菌A. cyanogriseus WH1-2216-6中克隆和鉴定了CRM A的生物合成基因簇，阐明了CRM A中二联吡啶环的骨架结构起源于杂合的聚酮合酶/非核糖体肽合成酶（PKS/NRPS）途径，并发现了一种独特的生物合成策略。通过氨基水解酶切除保护基团（L-亮氨酸），确保生物合成途径往下游进行，揭示CRM A生物合成中的CrmG催化的氨基转移过程、二元组分单加氧酶CrmH催化的肟基形成机制和CrmM催化的甲基化过程，从而完整解析了CRM A生物合成的后修饰过程（图1）。

 
图1. 浅蓝霉素A（CRM A 1）的生物合成基因簇及其生物合成途径

氨基转移酶复杂的“乒乓”转氨机制导致CrmG转氨过程非常缓慢，同时发现CrmH催化产生的产物(Z)-CRM H6极不稳定，自发脱肟生成醛基，两个方面的原因导致了醛基化合物CRM M 4在细胞内会大量累积。而醛基产物往往会与细胞内其他蛋白的胺和硫醇发生加成反应产生毒性，为消除毒性，醛基会在细胞内被还原成酸或醇。在crmG突变株中发现的累积产物是CRM P 7而不是预想的产物CRM M 4。在CRM生物合成基因簇的末端存在一个编码核黄素氧化酶的基因crmK，其突变株仍能生产CRM A 1，表明crmK在浅蓝霉素A的生物合成过程中是非必须基因。意外的是，在crmK突变株中同时发现了副产物CRM P 7。体外生化实验证实CrmK能够以CRM P 7为底物进行两步连续的氧化反应，顺次生成CRM M 4和CRM O 3。酶动力学研究表明第二步氧化反应CRM M 4至CRM O 3在细胞内很难发生，这样即保证了副产物CRM P可以被重新利用，同时又避免了过度氧化导致能量的浪费（图2）。晶体结构解析显示CrmK采用两个独立的催化位点保证CRM P 7到CRM M 4的转化，为CrmK高效催化醇到醛提供了进一步的理论依据。

图2. 浅蓝霉素A生物合成中底物补偿机制的发现

上述成果主要由朱义广博士、徐进新博士、付鹏博士和梅显贵等完成，获得了国家自然科学基金委、科技部、中科院和广东省等的项目资助。

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