内毒素检测知多少（上篇）

来源：作者：人气：-发表时间：2019-10-28 14:08:00【大中小】

内毒素（endotoxin）是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分，叫做脂多糖。脂多糖对宿主是有毒性的。内毒素只有当细菌死亡溶解或用人工方法破坏菌细胞后才释放出来，所以叫做内毒素。

肠道杆菌多为革兰氏阴性杆菌，具有内毒素，若引起败血症、脑膜炎等感染时，可用血液、脑脊液及体液等检测内毒素，以协助临床诊断。另外，在生产药剂等过程中，自然环境中产生内毒素的细菌也常污染注射制剂、生物制品等，出厂前也要严格检查。内毒素的检测在现代临床生物技术中越发显得重要，西宝生物作为Wako的一级代理商致力于生命科学领域十多年，可为广大客户提供内毒素检测的整体解决方案，从仪器设备和相关试剂和耗材等

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【什么是内毒素】

内毒素一种在革兰氏阴性菌细胞壁中发现的脂多糖（LPS）。它是一种典型的热原，哪怕是皮克级（10^-12g）或纳克级的（10^-9g）内毒素进入血液，也会引发各种生物反应。因为其有着耐热性和稳定性，通过高压蒸汽处理也不能完全使内毒素灭活，需在250℃或以上的温度下，干热处理至少半小时才能使其灭活。它存在于革兰氏阴性菌栖息的环境中（例如水，空气），即使在细菌死亡后，细菌性的内毒素（LPS）仍然存在。

图1. 脂多糖（LPS）结构示意图

图1为脂多糖的结构图如图所示，脂质A在该物质中是负责生物活性的主要部分，这部分的分子量约为2000。包含糖链部分在内的整个分子的分子量一般为5000到8000左右。然而，因为内毒素是一种同时拥有亲水区（糖链）和疏水区（脂质A）的分子，它能在水溶液中相互缔合，形成表观分子量为数十至数百万的胶束结构。有报告指出，胶束结构的变化，会影响其生物活性的强弱。

图2. 脂质A的结构（大肠杆菌型和沙门氏菌型）

图2所示为大肠杆菌型和沙门氏菌型的脂质A的结构。从图中能看出即使菌株不一样，脂质A的基本结构在大体上仍然相同。

【使用鳌阿米巴样细胞溶解物（LAL）试剂的各种内毒素检测方法】

由马蹄蟹（美洲鲎）的阿米巴样细胞溶解物制备的试剂可用于检测细菌内毒素。如图3所示，在内毒素的参与下，级联反应开始进行，其中C因子，一种丝氨酸蛋白酶前体，先被活化。随后接下来的是B因子的活化，B因子也是一种丝氨酸蛋白酶前体和凝固酶前体，它能将凝集原水解成凝集素，形成不溶性凝胶。

在LAL测试中，内毒素可以通过三种方式定量：

对凝胶的形成进行测定
对浊度的增加进行测定
或对由合成底物分解而释放出的黄色色原体进行测定。

普通的LAL试剂不仅与内毒素反应，而且会与（1→3）-β-D-葡聚糖（真菌细胞壁成分）反应，因为G因子途径会在LAL试剂作用下被激活。为了消除这种（1→3）-β-D-葡聚糖活化，在工业中通过去除G因子或抑制其活化，开发了各种内毒素特异性试剂。

市场上有着各种基于图3中的反应机理所制得的LAL试剂以及检测体系。因此，根据所需的准确度、测试频率、样本数目以及其他相关因素来选择合适的产品是十分重要的。

图3. LAL试剂反应机理

美国，欧洲和日本的药典中包含了三种内毒素检测方法，分别是凝胶法、比色法和比浊法，我们会在下面的章节中详述，并且会介绍相关的LAL试剂的特点以及其应用实例。

(1) 凝胶法

将样本与LAL试剂在试管中混合，并使用干浴器，在37±1°C下，孵育60±2 min，期间不要振动。加热完成后，立即缓慢地将试管倾斜180°。如果凝胶已形成并能保持其完整性而不变形或塌陷，则结果可确定为阳性，而如果未形成凝胶则为阴性。在检测期间，对于一系列样本，要进行多倍稀释（通常为2倍），以检查每个样品的结果是否为阳性。

相关试剂：

在单次型试剂盒和多次型试剂盒中都包含LAL试剂，其中单次型试剂盒中的反应小瓶包含了预分装好的用于单次检测的LAL试剂，而多次型试剂盒则是将所需量的已经溶解好的LAL试剂装入到反应瓶中。单次型试剂盒适用于少量样品的检测，而多次型试剂盒则适用于样本量更多的检测。

多次型试剂盒的使用方法式是将0.1 mL已经溶解好的LAL试剂分装到反应管中，然后再加入0.1 mL样品，并将其混合。而单次型试剂盒的使用方法则是将0.2 mL样本加入到含有预先分装好的LAL冻干试剂的反应小瓶中。

ES-II系列

特异性内毒素LAL试剂（不会被（1→3）-β-D-葡聚糖活化），与细菌内毒素检测（BET）（日本药典）相兼容。其胶凝灵敏度为0.015 EU/mL，单次型和多次型试剂盒均有提供。

（2）比色法

由于内毒素会使LAL试剂活化，比色法是根据其对显色底物的分解来检测其活化。由于对硝基苯胺的黄色的吸光度是在405 nm波长下检测的，如果样品在约405 nm波长下具有相当大的光吸收，则不宜使用比色法。

相关试剂

Color KY 系列

内毒素特异性比色法LAL试剂，与BET（日本药典）一致性测试相兼容。与Toxinometer® 结合使用的单次型试剂盒，以及与酶标仪和Toxinometer® 结合使用的多次型试剂盒，可用于动态比色测试。这些系列在我们的试剂产品有着高的灵敏度：检测限为0.0002 EU/mL（单次型）和0.0005 EU/mL（多次型）。

（3）比浊法

比浊法利用凝胶浊度的变化来检测由内毒素诱导所产生的LAL试剂的活化。它不适用于具有一定浊度的样品。

ES-F系列和ES-II系列

在动态比浊法测量中，可以将ES-F系列、ES-II系列与酶标仪和Toxinometer® 结合使用。这些试剂盒不仅能获得凝胶法的结果，同时能得到动态比浊法的数据，测量时间为60 min。

【对检测用具的要求】

用于内毒素检测的所有检测用具必须不含内毒素和β-葡聚糖。为使内毒素失活，需要在250°C下干热处理超过30 min。建议使用经干热灭菌的玻璃器皿。避免使用金属工具，因为即使有少量被洗脱出的金属离子（例如铁，铝，镓，铬），也可能影响测试。而当使用一次性塑料工具（其制造商未能保证其能用于检测用途）时，检查它们是否满足以下要求（与玻璃器皿相比）：1）未被内毒素污染; 2）不吸附内毒素; 3）无洗脱物。

【内毒素产品列表】

货号	品名	规格
295-72301	Limulus Amebocyte Lysate PYROSTAR (TM) ES-F SINGLE TEST SENSITIVITY 0.015 EU/mL (25 LAL Reagent vials + 1 CSE vial) 鲎阿米巴样细胞裂解物PYROSTAR™ES-F单次测试灵敏度0.015 EU/mL	25 tests
291-75701	Limulus Amebocyte Lysate PYROSTAR ES-F MULTI TEST (without CSE) 鲎阿米巴样细胞裂解物PYROSTAR™ES-F多次测试（不含CSE）	100 tests
295-51301	Limulus ES-2 Single Test wako 鲎试剂ES-2 Single（适用于溶胶凝胶法和动态比浊法）	25 tests
299-51201	Limulus ES-2 Test wako 鲎试剂ES-2 （适用于溶胶凝胶法和动态比浊法）	60 tests
292-51213	Limulus Amebocyte Lysate ES-II, Lyophilized 鲎试剂LAL ES-II（适用于溶胶凝胶法和动态比浊法）	2 ml×5
293-75401	Limulus Amebocyte Lysate PYROSTAR ES-F/Plate (with CSE) 鲎阿米巴样细胞裂解物PYROSTAR™ES-F/板（含CSE）	160 tests
297-75301	Limulus Amebocyte Lysate PYROSTAR ES-F/Plate (without CSE) 鲎阿米巴样细胞裂解物PYROSTAR™ES-F/板（不含CSE）	200 tests
291-53601	Limulus Color KY Single Test wako 鲎试剂比色法KY单次测试	25 tests
291-53101	Limulus Color KY Test Wako 鲎试剂比色法KY多次型	60 tests
290-33771	Toxinometer ET-6000/J Standard Set 内毒素检测仪ET-6000/J	1 set
291-35761	Toxinometer ET-7000/J Standard Set 内毒素检测仪ET-7000/J（升级版）	1 set