PEG修饰剂在蛋白质和肽类药物中的应用

来源：作者：人气：-发表时间：2023-07-05 09:25:00【大中小】

PEG可以与药物共价结合形成复合物，用于控制药物的释放，延长药物的半衰期，降低免疫原性和抗原性，降低毒性，增强药物靶向性，减少剂量和给药频率。PEGylation可以改善许多药物的药动学和药效学性质。

蛋白质类药物主要包括细胞因子、酶、抗体、激素等一些具有特殊功能的蛋白质。由于天然或重组的未经修饰的蛋白质类药物具有半衰期短、有一定的免疫原性、溶解度低、毒副作用大、易被蛋白酶降解等缺点，从而减弱了其临床效果。

目前，用于预防、治疗和诊断疾病的多肽类药物主要包括多肽疫苗、抗肿瘤多肽、抗病毒多肽、多肽导向药物、细胞因子模拟肽、抗菌性活性肽、诊断用多肽以及其他药用小肽等。

修饰机理

PEG修饰蛋白质和肽类药物可以延长药物的半衰期、降低免疫原性，同时尽量保留其生物活性。其机理为：蛋白质经过PEG化学修饰之后，修饰剂与蛋白质分子偶联，使得蛋白质的分子量增大，空间结构发生改变。PEG在被清除前不会被降解，PEG的屏障作用保护了蛋白质不易被蛋白酶降解，同时减少了抗体的产生，当修饰后的蛋白质分子量达到或超出肾小球滤过作用的闵值时，蛋白质随血液循环进入肾脏后就可以逃避肾小球滤过作用，因而可以在血液循环中停留更长的时间。

主要修饰位点

在构成蛋白质的20种常见氨基酸中，只有具有极性的氨基酸残基的側链基团才能够进行PEG修饰。其亲核活性通常按下列顺序依次递减：巯基>α-氨基>?-氨基>羧基>羟基。常用的氨基酸是蛋白质序列中的半胱氨酸、赖氨酸以及氮末端和碳末端氮基酸。

PEG和蛋白质或多肽之间的反应主要为酰化反应、烷基化反应、氧化还原反应、芳香环取代反应等，对蛋白、肽类药物修饰途径主要有氨基修饰（包括N端氨基的酰化修饰、赖氨酸侧链氨基的酰化修饰、N端氨基的烷基化修饰）、羧基修饰、巯基修饰，还有其它如控制pH选择性修饰蛋白质侧链基团、金属离子或酶催化、糖蛋白中糖基定点修饰等。

1）氨基修饰

氨基修饰常用修饰剂为PEG-SS、PEG-SC、PEG-SPA、PEG-NHS、PEG-BTC、PEG-CHO、PEG-ALD、PEG-tresylate和PEG-epoxide等。

人类白细胞抗原（Human leucocyte antigen, HLA）是保持个体稳定的一组糖蛋白，在移植免疫中起着重要作用。为了研究mPEG 有效修饰HLA 抗原，阻断HLA 抗原与其相应抗体间特异性免疫反应的方法。随机挑选41例无偿血清10ml，用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，用HEPES/RPMI-1640 洗涤3次，调细胞浓度至每毫升2×105左右。在22℃，pH 7.4的PBS介质中，采用浓度梯度法用mPEG-BTC（MW 5kD）修饰淋巴细胞表面HLA-I类抗原。结果显示经mPEG-BTC取代后的淋巴细胞表面HLA-I类抗原与其相应抗体间的微量淋巴细胞毒试验为阴性。也就是经mPEG修饰后可以完全阻断HLA- I类抗原与其相应抗体间的特异性免疫反应[1]。

将奥曲肽与SPA-mPEG（MW 2000）或ALD-mPEG（MW 2000/5000）进行化学改性，通过生物活性检测发现，SPA-mPEG修饰的奥曲肽显示出较低的活性，而ALD-mPEG定点修饰在奥曲肽的N末端，生物活性没有降低且ALD-mPEG 5K能显著改善药代动力学特性[2]。

2）巯基修饰

蛋白质中和多肽中只有半胱氨酸含有巯基，利用巯基的高亲核性，可以选取能定向修饰蛋白质和多肽的PEG修饰剂。相对没有半胱氨酸的蛋白质，可以通过基因工程手段或是Traut’s试剂（2-亚氨氢氯化硫醇）处理蛋白引入巯基反应位点。常用修饰剂为PEG-Mal、PEG-OPSS、PEG-VS、PEG-IA、PEG-DAQ和PEG-Se等。

人睫状神经营养因子(human ciliary neuronotrophic factor,hCNTF)在中枢神经系统中可以促进神经干细胞的增殖，抑制其向胶质细胞的分化，具有保护受损神经元的功能。采用mPEG-MAL（MW 40kDa），对重组人睫状神经营养因子突变体CNTF-C17的第17位半胱氨酸巯基进行定点修饰。实验结果表明，在pH 8.0的Tris-HCl缓冲液体中，蛋白质与修饰剂的比例为1:3，4℃下反应12h，修饰率可达到90%以上，通过阴离子交换层析可获得纯度95%以上的单修饰产物。通过药代动力学考察，体内循环半衰期相对原蛋白显著提高了30.3倍[3]。

3）羧基修饰

羧基修饰位点包括天冬氨酸、谷氨酸及末端羧基。首先需将羧基活化，即先将PEG中的羧基转化为氨基，再在DCCI或EDC存在下与蛋白质的羧基结合，常用的修饰剂为PEG-HZ或PEG-NH2[4]。

单链聚乙二醇只有末端可用于修饰新型偶联药物，因此载药量较低。后续不断开发出支链聚乙二醇，支链结构在一个或多个端上具有官能团，如末端呈树枝结构的支链PEG、叉状PEG和多臂PEG等，从而实现多种共轭可能性，且大大增加了载药量。

PEG修饰剂列表

货号	品名	描述
ECS4133A	mPEG-NHS, MW 350	mPEG-Succinimidyl ester
AJL0190A	mPEG-SC, MW 1K
ACS0112B	mPEG-SC, MW 2K
ECS4382A	mPEG-SC, MW 3.4K
AJL0190B	mPEG-SC, MW 5K
ACS0115B	mPEG-SC, MW 10K
ECS4219A	mPEG-SPA, MW 1K	mPEG-Succinimidyl Propionate
ECS4356A	mPEG-SPA, MW 2K
ECS4275A	mPEG-SPA, MW 5K
ECS4094A	mPEG-SPA, MW 20K
ECS4284A	mPEG-SS, MW 5K	mPEG-Succinimidyl Succinate ester
ECS2001A	mPEG-SCM, MW 20K	mPEG-Succinimidyl Carboxymethyl Ester
ECS2103A	mPEG-SCM, MW 40K	mPEG-Succinimidyl Carboxymethyl Ester
ECS4171A	mPEG-SG, MW 2K	mPEG-Succinimidyl Glutarate ester
ECS4334A	mPEG-SVA, MW 5K	mPEG-Succinimidyl valerate
ECS4154A	mPEG-Mal, MW 350	mPEG-Maleimide
ECS4155A	mPEG-Mal, MW 500
ECS4156A	mPEG-Mal, MW 1K
DCS0133A	mPEG-Mal, MW 2K
ECS4168A	mPEG-Mal, MW 4K
ACS0135B	mPEG-Mal, MW 5K
ACS0136A	mPEG-Mal, MW 10K
ACS0137A	mPEG-Mal, MW 20K
ECS4150A	mPEG-ALD, MW 1K	mPEG-Aldehyde
ECS4194A	mPEG-CHO, MW 2K
ACS0121A	mPEG-CHO, MW 5K
ECS4212A	mPEG-EPO, MW 550	mPEG-Epoxide
ECS4198A	mPEG-EPO, MW 2K
ECS4182A	mPEG-EPO, MW 10K
ECS4317A	mPEG-HZ, MW 350	mPEG-Hydrazide
ECS4278A	mPEG-HZ, MW 2K	mPEG-Hydrazide
ECS4157A	mPEG-NH2, MW 350	mPEG-Amine
ECS4244A	mPEG-NH2, MW 550
ECS2165A	mPEG-NH2, MW 1K
ACS0105B	mPEG-NH2, MW 2K
ACS0106B	mPEG-NH2, MW 3.4K
ECS4296A	mPEG-NH2, MW 4K
ACS0107B	mPEG-NH2, MW 5K
ECS2180A	mPEG-NH2, MW 10K
ACS0109B	mPEG-NH2, MW 20K
ECS2069C	Mal-PEG-SCM, MW 2K	Maleimide-PEG-Succinimidyl Carboxymethyl Ester
ECS2069B	Mal-PEG-SCM, MW 5K
ECS2069A	Mal-PEG-SCM, MW 10K
ECS4208A	Mal-PEG-NHS, MW 200	Maleimide-PEG-NHS
ACS1695B	Mal-PEG-NHS, MW 2K
ECS2072A	Mal-PEG-NHS, MW 3.4K
ECS2065A	Mal-PEG-NHS, MW 5K
ECS4137A	MAL-PEG-SVA, MW 5K	Maleimide-PEG-Succinimidyl valerate
ECS4192A	Mal-PEG-HZ, MW 2K	Maleimide-PEG-Hydrazide
ECS2005A	NHS-PEG-SH,MW 200	Thiol-PEG- Succinimidyl ester
ECS2006A	NHS-PEG-SH,MW 400
ECS2007A	NHS-PEG-SH,MW 500
ECS2017A	SH-PEG-NHS, MW 600
ECS2009A	NHS-PEG-SH,MW 800
ECS2010A	NHS-PEG-SH,MW 1K
ECS4307A	SH-PEG-NHS, MW 2K
ECS4407A	SH-PEG-NHS, MW 5K
ECS4205A	SH-PEG-NH2, MW 600	Thiol-PEG-Amine
ECS4095A	SH-PEG-NH2, MW 2K
ECS1978B	SH-PEG-NH2, MW 3.4K
DCS2049A	SH-PEG-NH2, MW 5K
ECS4142A	SH-PEG-NH2, MW 10K
ECS2096A	SH-PEG-COOH, MW 400	Thiol-PEG-Acid
ECS4245A	SH-PEG-COOH, MW 1K
ECS1991B	SH-PEG-COOH, MW 2K
ECS2021A	SH-PEG-COOH, MW 3.4K
ECS2118A	SH-PEG-COOH, MW 5K
ECS2182A	SH-PEG-CHO, MW 5K	Thiol-PEG- Aldehyde
ECS4174A	SH-PEG-SH, MW 400	Thiol-PEG-Thiol
ECS4173A	SH-PEG-SH, MW 600
ECS2084A	SH-PEG-SH, MW 2K
ECS4143A	SH-PEG-HZ, MW 10K	Thiol-PEG-Hydrazide
ECS4383A	SH-PEG-Biotin, MW 200	Thiol-PEG-Biotin
ECS4412A	SH-PEG-Biotin, MW 5K	Thiol-PEG-Biotin
ECS4292A	SC-PEG-SC, MW 400	Succinimidyl ester-PEG-Succinimidyl ester
ECS2117B	SC-PEG-SC, MW 2K
ECS4233A	SC-PEG-SC, MW 3.4K
ECS4264A	SC-PEG-SC, MW 5K
ECS4311A	SC-PEG-SC, MW 10K
ECS4255A	NHS-PEG-COOH, MW 3.4K	NHS-PEG-Acid
ECS2071A	NHS-PEG-VS, MW 3.4K	NHS-PEG-Vinylsulfone
ECS4135A	NHS-PEG-OH, MW 2K	NHS-PEG-Hydroxy
ECS4354A	SS-PEG-SS, MW 2K	Succinimidyl Succinate ester-PEG-Succinimidyl Succinate ester
ECS4172A	SG-PEG-SG, MW 2K	Succinimidyl Glutarate ester-PEG-Succinimidyl Glutarate ester
ECS4231A	SG-PEG-SG, MW 3.4K
ECS2129A	SPA-PEG-SPA, MW 3.4K	Succinimidyl Propionate-PEG-Succinimidyl Propionate
ECS4290A	SCM-PEG-SCM, MW 2K	Succinimidyl Carboxymethyl Ester-PEG-Succinimidyl Carboxymethyl Ester
ECS4195A	SCM-PEG-SCM, MW 5K
ECS4291A	SCM-PEG-SCM, MW 20K
ECS4298A	OPSS-PEG-NHS, MW 5K	Ortho-Pyridyldisulfide-PEG-NHS
ECS4082A	OPSS-PEG-SCM, MW 5K	Ortho-Pyridyldisulfide-PEG-Succinimidyl Carboxymethyl Ester
ECS4199A	AC-PEG-SC, MW 2K	Acrylate-PEG-NHS
ECS2051A	AC -PEG-SVA, MW 3.4K	Acrylate-PEG-Succinimidyl valerate
ECS2098A	AC-PEG-SCM, MW 2K	Acrylate-PEG-SCM
ECS4247A	Biotin-PEG-SCM, MW 600	Biotin-PEG-Succinimidyl Carboxymethyl Ester
ECS4343A	Biotin-PEG-SC, MW 2K	Biotin-PEG- Succinimidyl ester
EYD0528B	Biotin-PEG-SC, MW 5K	Biotin-PEG- Succinimidyl ester
ECS4248A	Biotin-PEG-SS, MW 600	Biotin-PEG-Succinimidyl Succinate ester
ECS4249A	Biotin-PEG-SG, MW 600	Biotin-PEG-Succinimidyl Glutarate ester
ECS4246A	Biotin-PEG-SVA, MW 600	Biotin-PEG-Succinimidyl valerate
ECS4162A	CHO-PEG-OH, MW 2K	Aldehyde-PEG-Hydroxy
ECS2174A	CHO-PEG-CHO, MW 2K	Aldehyde-PEG-Aldehyde

相关文献

[1]李伟, 张印则, 周华友, 兰炯采, 章扬培, 张志欣. mPEG 修饰HLA 抗原的方法学研究. 生命科学研究, 2003, 7(4): 374-376.

[2] Dong Hee Na, Kang Choon Lee, Patrick P DeLuca. PEGylation of octreotide: II. Effect of N-terminal mono-PEGylation on biological activity and pharmacokinetics. Pharm Res, 2005, 22(5): 743-9.

[3]冯翠, 王祺, 张纯, 秦培勇, 郑秀玉, 王健, 刘永东, 苏志国. PEG定点修饰重组人睫状神经营养因子及其生物活性评价. 中国生物工程杂志, 2015, 35(5): 15-21.

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