Francisco Mojica并不是第一个观察到CRISPR的研究者，但他却是第一个被CRISPR“深深打动”的人，他还记得，1992年的某一天当他首次看到微生物的免疫系统时，他就认为这或许能够带来一场生物技术的变革，随后Francisco Mojica对来自地中海富盐菌(Haloferax mediterranei)的基因组数据进行了分析，发现了14个不寻常的DNA序列，每个序列都有30个碱基对，这些序列的阅读顺序从前往后或从后往前都是相同的，而且会每隔35个碱基进行重复。

科学家深入解析CRISPR起源

当时这项研究发现并不是很受欢迎和重视，如今研究者以CRISPR来对成簇规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)进行命名，同时他们还发现，CRISPR-Cas能够帮助细菌抵御外来病毒的入侵，尽管CRISPR系统能够用来进行基因的编辑，但Mojica和其它研究者们关于该系统的工作机制仍然存在一些问题，这种微生物免疫系统是如何进化的？又是如何塑造微生物的免疫系统的？为何有些微生物能够使用其来抵御外来入侵病毒，而有些微生物则不能？

加利福尼亚大学的研究者Jennifer Doudna表示，近年来媒体对CRISPR系统带来的技术变革进行了大量的关注，如今基于该技术我们也看到了其所带来的不可思议的影响和机会，同时还有很多基础生物学的领域需要我们去深挖。

CRISPR从哪儿来

诸如CRISPR–Cas等系统的生物学优势显而易见，原核生物，比如细菌和古细菌，都会面对遗传入侵者的强烈攻击，而病毒会以远超细菌的数量来对细菌进行剿灭，而原核生物常常会交换一些片段，比如质粒，其能够吞噬来自宿主的资源，并且驱动宿主自我毁灭；与此同时原核生物还会进化出大量“武器”来应对病毒等外界威胁，比如限制性内切酶，其就是一种能够切断特殊位点或附近DNA的蛋白质，但原核生物的这些防御工事并不是很“锋利”，每一种酶都会被编程识别特定的序列，而当存在合适基因的拷贝时才会为微生物提供保护作用，而CRISPR–Cas系统就具有动态性的变化，其能够适应并且记住特殊遗传特性的外来入侵者，而这种方式就类似于在感染后人类机体抗体提供的长效免疫保护力一样，来自荷兰瓦赫宁根大学的研究者John van der Oost表示，当我们首次听到这种假设时，我们认为这对于简单的原核生物而言非常复杂。

随后当研究者Mojica及其同事观察到CRISPR的回文重复序列有时候能同病毒基因组进行匹配时，他们对CRISPR–Cas系统的功能进行了解析，从那时候开始，研究人员就开始对CRISPR相关的特殊蛋白（Cas蛋白）进行研究，当细菌遭受特殊病毒或质粒时，这种特殊蛋白能够将间隔区序列添加到细菌的基因组中，而间隔区序列制造的RNA还能够指导其它Cas蛋白切割外来DNA或RNA。

那么细菌和古细菌是如何拥有这些复杂免疫系统的呢？这个问题还有待于科学家进一步研究解答，如今一种主流的理论认为，基于转座子（跳跃基因）的系统能够从基因组中的一个位点跳跃到另一个位点；进化生物学家Eugene Koonin及其同事通过研究发现了一类能够编码Cas1蛋白的遗传移动元件，该元件能够插入到基因组的间隔区域中去，而这些“casposons”元件或许也是CRISPR–Cas免疫力的起源，如今研究者正在通过研究理解这些少量的DNA如何从一个位点跳跃到另一个位点，随后他们将继续通过研究追踪诱发CRISPR–Cas系统变得复杂的分子机制。

CRISPR如何工作的

近些年来科学家们通过研究阐明了Cas蛋白添加间隔区的多种分子机制，但病毒的DNA在化学结构上同宿主的DNA几乎相同，那么蛋白质如何知道哪种DNA能够被添加到CRISPR–Cas记忆系统中呢？

这样的“赌注”往往是很高的，如果细菌添加了自身的DNA片段，自身免疫攻击就会增加自杀的风险，因此细菌和古细菌有时候就会吸收一些错误，如果细胞在遭受病毒攻击后依然生长旺盛的话，少数细胞自杀可能并不太重要。实际上，当病毒潜入细菌生态系统中时，仅有千万分之一的细菌会获得能够为自身防御的间隔区，而且研究者对于研究驱动间隔区的机制也非常困难。

研究者表示，如何有效识别合适的间隔区非常重要，有些研究就表明，包含CRISPR–Cas分子机器的细胞或许能够充当多种多样的记录设备，其能够对遇到过的DNA和RNA序列进行分类，这就能够帮助研究人员追踪细胞中基因的表达或对环境化学物质的暴露情况；研究人员还想通过研究来阐明细菌中的这种古老记忆如何被修改，很多携带CRISPR–Cas系统的微生物都包含有十几个间隔区，而有些微生物则仅有1个间隔区，相比较而言，嗜热古细菌将其1%的基因组贡献给了5个CRISPR–Cas系统，其中包括458个间隔区。

目前在寻找古老间隔区上研究者积极性并不高，如果病毒会发生来避免CRISPR–Cas，那么间隔区或许就会退化，而且其或许会成为微生物保持额外DNA的负担。

一些间隔区的起源还会展现出另外一些奥秘，目前研究人员在DNA数据库中发现，不到3%的间隔区能够同一些已知的序列相匹配。大部分的测序结果都主要集中于受感染的人、牲畜或作物；在某些细菌中，CRISPR–Cas组分能够控制DNA的修复、基因表达和生物被膜的形成，其同时还能够帮助确定细菌感染诸如嗜肺军团菌等其它细菌的能力，嗜肺军团菌能够诱发军团病，该菌必须含有Cas2蛋白来感染其天然宿主—变形虫。

研究者Erik Sontheimer表示，研究人员同时还做出了一个平行的发现，那就是RNA干扰技术，该技术能够沉默植物、动物以及其它非原核生物有机体中的基因表达，之前研究者认为RNA干扰是有机体中的一种天然防御机制，此后研究者才注意到RNA干扰在调节宿主基因表达中所扮演的角色。代尔夫特理工大学的研究人员Stan Brouns表示，这或许能够解释为何某些间隔区并不能够与病毒或质粒进行匹配。

某些微生物能够使用CRISPR–Cas系统

不论CRISPR–Cas系统是否还具有其它功能，目前很明确的是，相比其它微生物而言，有些微生物能够很好利用该系统，有超过90%的古细菌都有基于CRISPR的免疫力，然而仅有三分之一被测序的细菌会被该系统所干扰。

大量的输血模型和早期的实验室研究都表明，CRISPR–Cas可能具有更多的优势，尤其是当同一些病毒做斗争的时候尤为明显，当添加的DNA转变成为基因组负担之前，CRISPR–Cas系统的间隔区往往能够记录非常有限数量的病毒序列，如果环境中病毒的多样性远远超过可能的间隔区数量时，CRISPR–Cas可能就没有那么有用了；另外一种可能性就是外部环境中的古细菌并不会依赖其它的防御手段，细菌抵御外来入侵者的常用方法就是对细菌外膜进行突变，而某些古细菌并不能够自由地修补这些外膜，因为外膜结构对于其在极端环境下生存只管中哟啊，这就使得诸如CRISPR的替代系统变得更加重要了。

人们更倾向于关注CRISPR–Cas9系统，因为该系统在基因组编辑上具有简单性和多样性，但微生物并不会对其偏爱，相反其会将该系统与其它不同的系统混合并且匹配，从而快速从其它细菌中选出新型系统而剔除掉古老的系统。

如今研究者正式鉴别出了6种不同类型的CRISPR系统，包括19个亚型，然而研究者仅仅知道其中一部分工作的机制。阐明这些CRISPR系统的工作机制对于研究人员发现CRISPR-Cas9系统的新型生物技术应用非常关键，比如研究者们所钟爱的CRISPR-Cas9就是一种II型系统，其能够利用间隔区转录的RNA分子来指导酶类对外来病毒和质粒DNA进行切割，但去年研究人员发现的VI型系统中的酶类却能够切割RNA，而且该系统中包含有和CRISPR-Cas9相关的某些基因，但同时又缺少能够插入到间隔区中的一些重复序列。

研究者Doudna表示，III型系统就是研究者发现的最为常见的CRISPR–Cas系统，目前有研究证据表明，CRISPR–Cas并不会对外来DNA或RNA产生反应，但却会对DNA转录到RNA的过程产生反应，如果被证明这是事实的话，那么其或许能够作为一种新型的调节形式来扩展CRISPR-Cas9用于基因组编辑的“工具箱”。

对于研究者Mojica而言，深入剖析和CRISPR相关的诸多基本问题往往比进行革命性的研究发现要更有吸引力，他痴迷于CRISPR-Cas9研究已经将近25年了，但后期他们还需要在这一领域内进行更多的研究。Mojica说道，我知道这是一种强大的工具，其能够用来治疗多种人类疾病，但我更关心的是阐明该系统如何自始至终地进行工作的。

【1】Five big mysteries about CRISPR’s origins

【2】Casposons： a new superfamily of self-synthesizing DNA transposons at the origin of prokaryotic CRISPR-Cas immunity
BMC Biology DOI： 10.1186/1741-7007-12-36

【3】Integrase-mediated spacer acquisition during CRISPR–Cas adaptive immunity
Nature doi：10.1038/nature14237

【4】Molecular recordings by directed CRISPR spacer acquisition
Science DOI： 10.1126/science.aaf1175

【5】Viral Diversity Threshold for Adaptive Immunity in Prokaryotes
mBio doi： 10.1128/mBio.00456-12

【6】Biochemical studies of tast sensation. Binding of L-[3H]alanine to a sedimentable fraction from catfish barbel epithelium.
J Biol Chem https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/403？dopt=Abstract&holding=npg

【7】C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector
Science DOI： 10.1126/science.aaf5573