西宝生物提供Ludger 糖基化分析2-AA 多糖标记试剂盒(2-aminobenzoic acid) Glycan Labeling Kit。

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2-AA 多糖标记试剂盒

货号：LT-KAA-A2
包装：原装进口

英文名：2-AA (2-aminobenzoic acid) Glycan Labeling Kit
别名：多糖标记试剂盒（2-氨基苯甲酸标记）
品牌：Ludger

西宝生物提供Ludger 2-AA 多糖标记试剂盒（2-AA Glycan Labeling Kit），货号：LT-KAA-A2。

*西宝提示：我司所销售的化学试剂、原料等所有产品（包括但不限于抗生素类、蛋白质类、试剂盒类产品等）仅限用于科学研究用途，不得作用于人体。

订购热线：400-021-8158

产品详情质检信息订购列表

LudgerTag™ 2-AA（2-氨基苯甲酸）多糖标记试剂盒（货号：LT-KAA-A2）包含经胺化还原反应使染料结合在多糖未结合还原端基的试剂，使用2-氨基苯甲酸（2-AA）标记未结合多糖。

应用：用2-氨基苯甲酸（2-AA）标记未结合多糖

染料性质

分子量 137

荧光 λex（染料） = 320 nm, λex（多糖结合染料） = 360 nm，λem = 420 nm

*我们建议激发波长为360纳米，以获得大的检测灵敏度

结构

样品数：通常每套标记试剂较佳情况下可分析15个独立样品。

样品量：每个样品含25pmol到25nmol多糖。

适合检测的样品：带有未结合还原末端的纯化聚糖，都可以进行标记。

结构完整性：未发现唾液酸、岩藻糖、硫酸盐或磷酸盐的损失（<2摩尔百分比）。

标记效率：通常大于85%（取决于样品）。

标记选择性：本质上是化学计量标记。

储存：室温下暗处储存。远离热源、避光和防潮。所供试剂至少可稳定保存两年。

运输：该产品可在室温下运输。

处置：使用时涉及的玻璃或塑料器皿以及溶剂，应确保不含糖化酶及外源性碳水化合物。在所有样品处理时，使用无粉末手套，避免受到外源性碳水化合物的污染。标记试剂设计的所有步骤都必须在干燥环境下操作，并使用干燥的玻璃和塑料器皿。一旦打开试剂瓶，应立即使用。多余试剂根据当地安全规则丢弃。

安全：仅供研究用。不得用于人体或药用。请阅读安全数据表（SDS）了解所有相关化学品。标记试剂涉及的操作，都应配备使用适当的个人安全保护装置 - 眼镜、耐化学性手套（如腈类手套），以及在实验室通风柜进行操作。

试剂盒组成

每个标记试剂盒包括1瓶以下试剂:

Cat.	# Item	Quantity
LT-2AA-01	2-AA染料 (2-氨基苯甲酸)	5 mg
LT-DMSO-01	二甲基亚砜 DMSO	350 μl
LT-ACETIC-01	冰醋酸	500 μL
LT-CYANOB-01	氰基硼氢化钠(还原剂)	6 mg

所需的其他试剂和设备

加热模块、炉或相近功能的干热器（不能使用水浴），设定在65°C
旋转蒸发仪（例如Savant, Heto, 或其它）
反应小瓶 (e.g. 聚丙烯微量离心瓶)
注：如果进行样品标记后洗涤（参见样品洗涤部分），则需要其它试剂。

标记操作时间线

LudgerTag 标记过程,加上可选样品标记后洗涤，通常需要4-5个小时：

过程	时间	总时间（小时）
样品转移到反应瓶并干燥	30分钟	0.5
配置并加入标记试剂	15分钟	0.75
样品和试剂一起培养	3 小时	3.75
标记后洗涤	1小时	4.75

还原性胺化

标记反应涉及一个两步反应过程。 (见图1):

1.希夫碱生成

具有未结合还原末端的多糖，其末端在闭环（有环）和开环（无环）状态之间处于平衡状态。染料的伯胺对无环还原端基残基的羰基碳进行亲核进攻，形成部分稳定的席夫碱。

2. 希夫碱还原

希夫碱亚胺基通过化学还原生成稳定标记的多糖。

图1:通过还原性胺化反应，用2-氨基苯甲酸标记多糖

标记操作概述

LudgerTag 多糖标记试剂盒，用于荧光或发色标记带有为结合还原端基的多糖。在所中色谱和结构序列分析中，经标记的多糖既可以进行高灵敏度荧光检测，也可以进行紫外吸收监测，包括使用LudgerSep液相色谱柱的色谱分析和使用外切糖苷酶的序列分析（参见参考1-5, 7)。

标记过程概述如下：

1 多糖准备

准备多糖样品，去除类似盐和洗涤剂等可能干扰标记过程的污染物。

2 多糖干燥

将样品置于反应小瓶中干燥。

3 标记试剂准备

将试剂盒中相关试剂混合制备新鲜的染料标记溶液。

4 将标记试剂加入多糖中

将小量的标记溶液加入每一份多糖样品中

5 培养

培养样品使标记反应进行下去。

6 标记后洗涤

培养完成后，如有必要（根据后续分析过程而定），直接进入洗涤流程以去除过量的标记试剂。.

7 经标记的多糖储存或者分析

经标记的多糖样品现在可以用于分析了。

样品准备

要进行标记的多糖样品，无论是纯化的或是多糖混合物，必须包含未结合的还原端基，颗粒状且不含无机盐，并溶于易挥发的溶剂体系中（建议是纯水）。

下列物质可能干扰标记反应，必须在进行LudgerTag™ 标记之前，事先从多糖样品中去除：

不挥发溶剂
不挥发盐，尤其是过渡金属离子
洗涤剂
染料和染色剂，例如考马斯蓝

Ludger提供了一系列LudgerClean™试剂盒，用于在Ludgertag™标记之前洗涤多糖样品。这些内容在LudgerClean多糖洗涤指南[参考6]中有详细说明。

标准样品制备概述如下：

1 多糖纯化

如有必要，从样品中按照多糖洗涤指南[参考6]中所述去除非碳水化合物污染物。

2 将样品转移至反应小瓶中

从典型糖蛋白中获得的多糖，样品量应在100个皮摩尔-50纳米摩尔的范围内。单一的纯多糖，即使仅有5皮摩尔的量，也可以被标记，并在之后高效液相色谱分析中检测出。适用的反应小瓶，包括小型聚丙烯微离心管和可用于PCR操作的试管。

3 样品干燥

理论上，应使用旋转蒸发器干燥样品。如果条件不允许，可以小心使用冷冻干燥（尤其要确保在小瓶的底部的样品，冻干成小而致密的物质）。不要将样品置于高温（>28℃）或极端pH环境下，因为这样会导致唾液酸在酸催化下耗损（高温、强酸），或多糖还原端的异构反应（强碱）。

标记试剂准备

按如下过程制备新鲜标记试剂：

4 制备DMSO-醋酸混合液

150μl冰醋酸加入盛有DMSO的小瓶中，并用移液器抽吸混合。

冰醋酸和DMSO的货号分别为LT-ACETIC-01和 LT-DMSO-01。

小心敲击安瓿瓶以震落附着安瓿上半部的内容物，然后小心打开安瓿瓶。

如果DMSO冻成固体，在烘箱或加热快上在30-65℃之间缓慢加热小瓶（在启封前）。

5 加入染料

将100μl DMSO-醋酸混合液加入LudgerTag™ 2-AA (2-氨基苯甲酸) 染料小瓶中，混合直至染料全部溶解。

染料货号为LT-2AA-01。

6 加入还原剂

将溶解的染料加入盛有LudgerTag™ 氰基硼氢化钠 (还原剂) 的小瓶中，使用移液器抽吸混合直至还原剂全部溶解形成最终的标记试剂。

氰基硼氢化钠还原剂的货号是LT-CYANOB-01。

如果还原剂难以溶解，那么在65℃的恒温培养箱中，或者加热块上，轻缓地加热至多4分钟。如还原剂仍未全溶，补加10μl纯水并混合均匀。

标记试剂应防潮，并在配置60分钟内使用。

标记反应

7 将标记试剂加入样品

将5μl标记试剂加入到每一份经干燥的多糖样品中，盖上离心管，彻底混合，然后轻轻敲击以确保标记溶液位于小瓶的底部。

8 培养

将反应小瓶放在65℃的加热块、砂浴或烘箱中，培养3小时。

培养必须在干燥的环境下进行。请使用培养箱或干燥块，请务必不要使用水浴。

样品必须全部溶解在标记溶液中，才能有效进行标记。为了促进全部溶解，样品可在培养温度达到65℃后涡旋混合30分钟，然后继续培养。

在大多数情况下，培养时间可以缩短至2小时或延长至4小时，而不会显著改变标记反应结果。

9 离心并冷却

培养结束后取出样品，短暂离心微量试管，并让其全部冷却至室温。

LudgerClean™ S 标记后样品洗涤

对于特定的应用 - 例如后续的HPLC分析，标记后的样品洗涤(去除多余的染料和其它标记试剂) 是必不可少的。使用LudgerClean™ S 小柱 (货号 LC-S-Ax, 此处x代表试剂盒中小柱的数量)按试剂盒所附标准操作程序可以完成样品洗涤。

对于过量标记试剂不会影响后续样品分析的应用而言，样品标记后洗涤并非必需。这些分析手段包括碳水化合物电泳，游离染料会从标记多糖条带处分离开。

LudgerTag™ 2AA标记多糖的分析

LudgerTag™ 2-AA标记多糖可通过一系列分析方法进行研究，包括HPLC，凝胶电泳和质谱。这些会在参考资料8里详细叙述，在下文也有概述。

高压液相色谱分析

LudgerTag™ 2-AA标记多糖混合物可以通过一系列HPLC（高压液相色谱）方法进行分离和分析，也包括LudgerSep HPLC:

分析类型	柱子	货号
带电荷和中性多糖的分离	LudgerSep™ C	LS-C-01
带电荷和中性多糖的剖面分析	LudgerSep™ N	LS-N-01
中性多糖的分离	LudgerSep™ R	LS-R-01

上述多糖分析柱的使用在参考4和参考8里有概述。

对于从复杂多糖混合物中纯化和分析LudgerTag?标记寡糖而言，LudgerSep N柱是很有效的分析工具。

关于您的特殊应用，请联系我们获取建议。

酶法分析

高纯度，测序级酶（例如外切糖苷酶）,适合N-和O-链接LudgerTag™ 标记多糖的结构分析，许多公司有市售产品。

选择糖苷酶时，尤其应注意选择配方与您专属应用匹配的产品。例如，部分酶和缓冲液拥有会干扰特定分析手段的组份。在选则您工作所需的酶和反应条件时，请致电我们获取指导。

质谱和电泳

LudgerTag™ 标记多糖也可以用质谱、电泳和其它光谱分析手段进行分析。如果您想确定合适的分析条件，请来电咨询。

参考文献及相关文献

1 Bigge, J.C.; Patel, T.P; Bruce, J.A.; Goulding, P.N.; Charles, S.M; Parekh, R.B. (1995) 'Non-selective and efficient fluorescent labeling of glycans using 2-aminobenzamide and anthranilic acid'. Analytical Biochemistry 230: 229-238

2 Guile, G.R.; Rudd, P.M.; Wing, D.R.; Prime, S.B.; Dwek, R.A. (1996) 'A rapid and high-resolution high-performance liquid chromatographic method for separating glycan mixtures and analyzing oligosaccharide profiles'. Analytical Biochemistry 240: 210-226

3 Townsend, R.R.; Lipniunas, P.H.; Bigge, C.; Ventom, A.; Parekh, R. (1996) 'Multimode high-performance liquid chromatography of fluorescently labeled oligosaccharides from glycoproteins'.Analytical Biochemistry 239: 200-207

4 LudgerSep High Resolution HPLC Carbohydrate Profiling Guide (Cat # LS-GUIDE-01)

5 Ludger Enzyme Selection Guide (Cat # EZ-GUIDE-01)

6 LudgerClean Glycan Cleanup Guide (Cat # LC-GUIDE-01)

7 Hardy, M.R. (1997)‘Glycan labeling with the fluorophores 2-aminobenzamide and anthranilic acid’in ‘Techniques in Glycobiology’, edited by Townsend, R.R and Hotchkiss, A.T.. Marcel Dekker Inc, New York .

8 Ludger Technical Note # TN-AA-01: Analysis of 2-AA (2-aminobenzoic acid) labeled glycans

故障排除

Ludgertag™标记过程是一种有效、可靠的方法。如果出现问题，通常可以毫无毫不费力地予以纠正。以下是有可能出现的问题、可能的原因和解决方案。

染料结合率低 / 标记收率低

标记温度不正确

请确保烘箱或加热块预设与培养温度相称，并确保反应管在标记时始终处于该温度下。

样品未全部溶解

多糖必须全部溶解在标记混合溶液中，标记效率才能放大化。

请确保在培养操作之前，样品与标记试剂全部混合均匀。作为预防措施，在培养开始后，继续仔细搅拌样品15分钟。

样品中含有干扰标记的污染物。

在标记之前，请确认多糖得到足够纯化（参见操作步骤1和 LudgerClean™ 多糖洗涤指南）

标记溶液无效。