Nature：重大发现！首次揭示噬菌体利用细胞核样区室保护自身基因组免受CRISPR核酸酶切割

来源：作者：人气：-发表时间：2019-12-23 10:24:00【大中小】

细菌和感染它们的病毒正在进行一场与生命本身一样古老的分子军备竞赛。进化为细菌配备了一系列可靶向并破坏病毒DNA的免疫酶，包括CRISPR-Cas系统。但是，杀死细菌的病毒（也称为噬菌体）已设计出了它们自己的工具来帮助它们战胜这些最强大的细菌防御。

如今，在一项新的研究中，来自美国加州大学旧金山分校和加州大学圣地亚哥分校的研究人员发现一种引人注目的新策略，一些噬菌体采用这种新策略来避免成为这些DNA切割酶的下一个受害者：在感染细菌后，这些噬菌体在细菌宿主内部构建了一种难以穿透的“区室”，从而保护脆弱的噬菌体DNA免受这些抗病毒酶的侵害。这种类似于细胞核的区室是迄今为止在病毒中发现的最有效的CRISPR屏蔽层。相关研究结果近期发表在Nature期刊上，论文标题为“A bacteriophage nucleus-like compartment shields DNA from CRISPR nucleases”。

图片来自Nature, 2019, doi:10.1038/s41586-019-1786-y

论文通讯作者、加州大学旧金山分校微生物学与免疫学系助理教授Joseph Bondy-Denomy博士说，“在我们的实验中，这些噬菌体并不屈服于它们遭遇的任何靶向DNA的CRISPR系统。这是首次在噬菌体表现出这种水平的泛CRISPR抵抗性（pan-CRISPR resistance）。”

寻找CRISPR无法切割的DNA

为了找到CRISPR抵抗性的噬菌体，这些研究人员从五个不同的噬菌体家族中选出病毒，并用它们感染一种经过基因工程改造以部署四种不同的Cas酶---CRISPR系统中切割DNA的组分---的常见细菌：铜绿假单胞菌。

这些经过CRISPR强化的细菌在对抗它们遇到的大多数噬菌体中取得了胜利。但是他们发现两种巨型噬菌体（jumbo phage）---如此命名是因为它们的基因组比研究最深入的噬菌体的基因组大5到10倍---对所有这四种CRISPR系统都不敏感。

这些研究人员决定对这两种巨型噬菌体进行测试，并探究它们的CRISPR抵抗性的极限。他们将它们暴露于配备了完全不同类型的CRISPR系统的细菌，以及配备仅能靶向有限数量DNA序列的限制修饰系统（restriction-modification system）---一种比CRISPR更普遍的DNA切割酶，这种限制修饰系统存在于大约90％的细菌物种中，而CRISPR仅存在于大约40％的细菌物种中---的细菌。结果和以前一样：培养皿中散落着被噬菌体感染的细菌爆裂后的残留物。

Bondy-Denomy说，“这真是令人吃惊，这是因为我们对这些细菌进行基因改造，使得它们能大量过量产生细菌免疫系统中的组分，但是它们中的任何一种都不能够切割噬菌体DNA。这两种噬菌体对所测试的所有六种细菌免疫系统均具有抵抗性。没有其他噬菌体能与之匹敌。”

巨型噬菌体似乎是坚不可摧的。但是试管实验表明：事实上，巨型噬菌体DNA与其他DNA一样，易受CRISPR和限制性内切酶的攻击。在噬菌体感染的细菌细胞中观察到的这种CRISPR抵抗性必须是这些病毒产生的某种东西干扰了CRISPR系统的结果。但是，这种东西是什么呢？

抗CRISPR蛋白（anti-CRISPR）是一个明显的罪魁祸首。这些蛋白由Bondy-Denomy于2013年首次发现，是某些噬菌体基因组中编码的强效CRISPR灭活剂。但是当这些研究人员分析巨型噬菌体的基因组序列时，他们却找不到抗CRISPR基因。此外，每种已知的抗CRISPR蛋白仅能让特定的CRISPR系统失去功能，而巨型噬菌体对它们遇到的每种抗病毒酶均具有抵抗性。因此保护巨型噬菌体DNA的东西一定是基于其他机制。

发现难以穿透的CRISPR屏蔽层

基于显微镜的实验最终揭示了其中的奥秘。当这些巨型噬菌体感染细菌时，它们会在宿主细胞的中间建立一种球形区室，从而将抗病毒酶拒之门外，并为病毒基因组的复制提供“安全室”。

经证实，这种球形区室与加州大学圣地亚哥分校的Joe Pogliano教授和加州大学旧金山分校的David Agard教授于2017年首次发现的一种区室结构完全相同。尽管这些研究人员先前已证实噬菌体基因组在这种细胞核样区室中复制，但直到现在为止还没有人知道这种区室还可以作为抵御CRISPR和其他DNA切割分子的不可穿透的屏蔽层。

尽管如此，关于这种区室和构建它的噬菌体的许多问题仍未得到解答，包括有关构建这种区室的蛋白的基本细节。

Bondy-Denomy说，“当对这两种巨型噬菌体进行测序时，发现了许多假定蛋白（hypothetical protein），而那些用于构建这种区室的蛋白仅是这些假定蛋白中的一部分，但是并不常见。它们甚至在一些相关的噬菌体中也没有发现。我们也并不知道它们的结构在原子水平下是什么样子的。”

但是，构建这种区室的蛋白基并不是Bondy-Denomy及其同事们渴望解决的唯一谜团。当这些研究人员在显微镜下监视被噬菌体感染的细菌时，他们注意到了一种不寻常的现象：在组装巨型噬菌体的安全室时，这一过程大约需要30分钟，它的基因组仍保留在被注射到宿主细胞的地方。在这段时间内，巨型噬菌体基因组似乎易受宿主细胞周围漂浮的任何抗病毒酶的攻击。但是不知何故，当它的安全室正在组装中时，它的基因组仍保持完整。

Bondy-Denomy说，“我们认为某种区室前体（pre-shell）可以在早期保护注入的DNA。这就像是在区室最终组装好时就会脱落下来的盔甲。但是我们不知道这种盔甲是什么。”他渴望弄清楚这些巨噬噬菌体如何在病毒生命周期的每一步保护自己免受CRISPR的攻击。

这些研究人员还发现，这种区室并不像最初的实验所提示的那样坚不可摧。论文第一作者、Bondy-Denomy实验室研究生Senén Mendoza通过一些巧妙的工程设计，发现通过将一种限制性内切酶连接到其中的一种病毒区室蛋白上就可绕过这种细胞核样区室的屏蔽。这种特洛伊木马策略使得这种切割DNA的限制性内切酶连可以在区室组装过程中潜入区室内，并在原本被认为是无免疫力的区域内切割噬菌体基因组，从而使细菌得以生存。

这项实验令这些研究人员特别兴奋，这是因为它表明实际上有一些方法可以突破这种“难以穿透的”安全室。考虑到细菌和噬菌体一直在寻找破坏对方防御的新方法，Bondy-Denomy认为，科学家们最终将发现细菌已配备了突破或绕过这种细胞核样区室所需的工具。

Bondy-Denomy说，“我们正在寻找细菌绕过这种区室的方法。在这场斗争中，这绝不可能是最重要的部分。也许有些细菌将一种免疫酶融合到噬菌体蛋白上，然后找到进入这种区室的途径。或者细菌会偷取噬菌体基因用于抵抗噬菌体。我想我们最终会发现，细菌已想出了很多方法来对抗制造这些区室的噬菌体，我们可能会对它们实现这一点的做法感到吃惊。”

参考资料

1. Senén D. Mendoza et al. A bacteriophage nucleus-like compartment shields DNA from CRISPR nucleases. Nature, 2019, doi:10.1038/s41586-019-1786-y.

2. CRISPR-resistant viruses build 'safe rooms' to shield genomes from DNA-dicing enzymes