茶多糖（Tea polysaccharides，简称TPS）是茶叶中具有特殊生物活性的一类与蛋白质结合在一起的酸性多糖或酸性糖蛋白。药理研究表明，茶多糖具有显著的降血糖效果和免疫活性，使茶多糖有望成为预防与治疗糖尿病和心血管疾病、提高免疫功能的天然药物。近年来，大多数研究表明茶叶中茶多糖的重要功能，但在茶多糖的检测方面，高效、便捷、快速的方法还很欠缺。
离子色谱法测定糖类逐渐被学者们所关注，鉴于糖类化合物分子具有电化学活性和在强碱溶液中呈离子化状态，Roxklin等于1983年首先报道了用阴离子交换色谱柱分离，脉冲安培检测器测定糖的新方法。本文运用温水浸提，乙醇沉淀，超声辅助乙酸水解法，方便、高效的提取了茶叶中的多糖，并以NaOH溶液作为流动相，研究了用离子交换色谱分离-脉冲安培检测半乳糖、葡萄糖、甘露糖和果糖的方法。
1 实验部分：
1.1 仪器和试剂
仪器：瑞士万通公司（Metrohm）861 Advanced Compact IC，817 Bioscan脉冲安培检测器，833 IC Liquid Handing Unit蠕动泵，METROSEP CARB 1（150×4.0mm）阴离子交换柱，色谱工作站为Metrohm IC-Net 2.3。
试剂：半乳糖、葡萄糖、甘露糖和果糖标样，绿茶，普洱茶，乌龙茶，红茶。
1.2 色谱条件
分离柱：METROSEP CARB 1（150×4.0 mm）阴离子交换柱，淋洗液：6 mmol/L NaOH溶液，流速：1.0 mL/min，进样量：20 μL，柱温：32℃，再生液：200 mmol/L NaOH。
1.3 标准溶液和样品溶液的配制
（1）标准溶液的配制：
称取半乳糖、葡萄糖、甘露糖和果糖标样0.10g，分别溶于100mL容量瓶中，配制成1000mg/L标准储备液。
超纯水稀释储备液分别配制半乳糖、葡萄糖、甘露糖浓度为2.0、5.0、10.0、20.0、30.0、
40.0 mg/L和果糖浓度为4.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 mg/L的标准溶液。
（2）样品溶液的配制：
A．粗多糖的提取：
分别取20 g绿茶、普洱茶、乌龙茶、红茶粉碎后，水浴加热250 mL温水浸提120 min，超声波辅助浸提，用布氏漏斗抽滤后，滤液用旋转蒸发仪减压浓缩，温度控制在70℃，浓缩至10 mL左右，用三倍体积95%乙醇沉淀，放置冰箱冷藏，静置过夜后抽滤，沉淀用无水乙醇、丙酮、乙醚交替洗涤2次，放置于恒温箱中低温干燥至恒重（70℃）。
B．粗多糖的水解：
本实验利用超声辅助乙酸水解法，分别称取上述四种茶叶粗多糖0.2 g，用50 mL1mol/L
乙酸水解，超声波作用时间为120 min。同时尝试了直接用水水解，但试验效果不佳。
2 结果与讨论
2.1 淋洗液的选择：
调节淋洗液NaOH浓度分别为1.0、2.0、5.0、6.0、7.5、10.0、15.0、20.0、50.0、100.0、
200.0 mmol/L，分析含有半乳糖、葡萄糖、甘露糖、果糖4种单糖的标准溶液。由于半乳糖、
葡萄糖和甘露糖属于差相异构体和位置异构体，流动相的浓度应小于20.0 mmol/L，才可使这三种单糖达到分离。通过对比发现在NaOH浓度为6.0 mmol/L时，4种单糖峰分离效果好，且保留时间适中。但是，在低浓度的条件下，由于脉冲安培检测器是在碱性条件下（pH>12）的电化学响应下实现的，所以检测的灵敏度降低，重现性变差，且每次进样前色谱柱需要再生处理，用高浓度氢氧化钠（200.0 mmol/L）平衡柱子。
2.2 标准曲线的绘制与最低检测限的测定
在优化的分离测定条件下，分析标准溶液，以峰高定量，其分离情况见图1。
图1 4种单糖标准样品的色谱图（半乳糖、葡萄糖、甘露糖20 mg/L，果糖30mg/L）
以单糖的色谱峰高（Y）对其质量浓度（X，mg/L）进行线性回归，标准曲线见图2~5，
得到线性回归方程。半乳糖为：Y=46.07467X+39.26354，R=0.99908；葡萄糖为：
Y=39.83798X+31.67077，R=0.99941；甘露糖为：Y=20.09056X-73.50196，R=0.99972；果糖为：Y=1.85911X+3.46878，R=0.99973。线性范围为2.0~50.0 mg/L。进一步稀释质量浓度为2mg/L的标准溶液测定其最低检测限，得到最低检测限为0.125mg/L~2.0mg/L
2.3 重现性试验
取20 mg/L的半乳糖、葡萄糖、甘露糖和30 mg/L的果糖混合液适量，按照上述优化后的色谱条件分别连续进样7次，得4种单糖峰高测定值的相对标准偏差（RSD）如下：半乳糖为：6.10%、葡萄糖为：5.82%、甘露糖为：14.19%、果糖为：9.88%。4种单糖保留时间的RSD如下：半乳糖为：2.12%、葡萄糖为：2.03%、甘露糖为：2.25%、果糖为：2.26%。
2.4 样品测定和加标回收率试验
准确称取绿茶粗多糖20 mg、移取普洱茶、乌龙茶、红茶粗多糖水解液5mL各三份，向其中分别依次加入20 mg/L混标溶液2.5 mL；4种单糖的标准储备液半乳糖、葡萄糖、甘露糖0.1 mL，果糖0.2 mL；40mg/L混标溶液5 mL。并定容至10 mL。按照优化后的色谱条件进行色谱分析，计算加标回收率，结果如表1示，样品色谱图见图2~5。
表1 样品测定和回收率的试验结果
3 结论
本研究建立了高效离子交换分离-脉冲安培检测多糖中半乳糖、葡萄糖、甘露糖和果糖的方法。方法灵敏度高，准确性好，操作简单。但在果糖的测定上还存在一定的欠缺，且试验稳定性差，可以进一步研究改善。将该法用于实际样品的测定，实用性强。
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