层析操作通常包括装柱、平衡、进料、淋洗、洗脱、再生等步骤。具体的操作方法如下（以20 cm×1.6 cm I.D., H=7.5 cm, CV=15 mL为例）：

1. 平衡：用5~10CV的平衡缓冲液（Buffer A，如20 mM PB, pH7.0，具体的缓冲体系应根据目标蛋白的稳定性和等电点、离子交换介质的种类进行筛选和优化）以2-5mL/min的流速平衡层析柱，至流出液电导和pH不变（与平衡液一致）。
2. 进料：样品缓冲液应尽可能与平衡液一致。固体样品可用平衡液溶解配制；低浓度样品溶液可用平衡液透析或添加相应量的盐；高浓度样品溶液可用平衡液稀释。为了避免堵塞层析柱，样品应经离心或微滤（0.45 μm）处理。进料量根据介质的载量和料液中目标蛋白的含量计算。
3. 淋洗：以2-5 mL/min的流速上样，并继续用平衡缓冲液淋洗至基线。
4. 洗脱：用洗脱缓冲液（20 mM PB+1 M NaCl, pH7.0，也可采用pH梯度洗脱）以2-5mL/min的流速洗脱（可采用线性梯度洗脱或阶越梯度洗脱），收集流出液。
5. 再生：每次层析之后可用1-2 M NaCl清洗层析柱，除去强结合的蛋白。

6. 原位清洗：介质使用数次（具体次数与原料的种类和来源及实验要求有关）后，需要对介质进行在位清洗：

   （1）对于通过离子键强结合的蛋白，可用2 M NaCl以1-2 mL/min的流速反向清洗10-15 min；
   （2）对沉淀蛋白、疏水性结合的蛋白、脂蛋白，可用1 M NaOH以1-2 mL/min的流速反向冲洗3-4 CV；
   （3）对强疏水性结合的蛋白、脂蛋白和脂类物质，可用70%乙醇或30%异丙醇以1-2 mL/min的流速反向冲洗3-4 CV（使用高浓度的有机溶剂时，为了避免产生气泡，应采用逐步增加有机溶剂浓度的方法）。
7. 保存：4-30℃下20%乙醇中保存（4℃下有利于长期保存）；层析柱中的介质可用20%的乙醇冲洗后保存于4-30℃。
8. 其它注意事项：在装柱、使用和保存柱子的时候，要避免柱子流干或密封不严，防止气泡进入。