NHS活化偶联介质——层析介质优选西宝生物
NHS活化偶联介质可用于各种含有氨基的亲和配基(蛋白质、多肽、糖等)的偶联,应用广泛。西宝生物NHS-activated QZT 4FF活化偶联介质以自制的琼脂糖凝胶为基质,经过一系列的活化、偶联步骤,并形成活化酯,在温和的条件下就可以偶联各种带氨基的配基。NHS-activated QZT 4FF活化偶联介质具有使用方便、偶联条件温和、偶联效率高和应用范围广的特点。
基质
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4%交联琼脂糖凝胶
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活化基团
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NHS
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形状
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球形
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介质平均粒径
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90 μm (45-165)
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活化基团密度
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18-25 μmol/mL wet gel
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偶联条件
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pH 6-9, 4 ℃–室温, 2-24 h |
流速可高达(25℃)
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450 cm/h
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推荐流速
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150 cm/h
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耐压可高达
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0.3 MPa (3 bar)
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保存
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-20 ℃(100%异丙醇)
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*:除4FF基质外,也可以提供4B、6FF和6B基质的NHS活化介质。
具体的操作步骤如下(以4 mL活化胶偶联BSA为例):
- 准确称取40 mg BSA溶于4.0 mL 0.2 M NaHCO3+0.5 M NaCl,pH 8.3缓冲液,溶解完全后备用。
- 将约4 mL NHS活化胶用4度预冷的1 mM HCl洗3-5次后抽干,再用0.2 M NaHCO3+0.5 M NaCl,pH 8.3清洗2次,抽干后将4 mL NHS活化胶(约3.0 g)加入到10 mL的反应器(磨口三角瓶或离心管)中(注意:清洗后应立即使用)。
- 将BSA溶液加入到活化胶中,反应温度恒定在4℃(或室温/25℃),摇床中振荡混合(离心管水平放置),转速120 rpm,反应过夜(或5h)。
- 反应停止后,静置,取上清离心(3000 g,5 min,室温),收集上清液用于未偶联BSA的浓度分析(可采用Bradford、Lowry、BCA法,NHS 在280 nm有强吸收,不能采用OD280测定蛋白浓度),计算偶联的BSA的配基密度;将其余料液转移到砂芯漏斗中用去离子水清洗、抽干。
- 封闭未反应的NHS:将4 ml抽干的BSA亲和胶加入到25ml磨口三角瓶中,加入9 ml 0.5 mol/L乙醇胺+0.5 M NaCl,pH 8.3溶液(或0.1 mol/LTris-HCl,pH 8.3)。反应温度恒定在4℃(或室温/25℃),搅拌速度120 rpm,反应过夜(或5 h)。反应停止后将料液转移到砂芯漏斗中抽干,用去离子水清洗。
- 清洗:将制得的BSA琼脂糖凝胶依次用5倍的去离子水、0.1 M 含0.5 M NaCl的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH 4.0)、去离子水、0.1 M 含0.5 M NaCl的硼酸-四硼酸钠缓冲液(pH 8.0)和去离子水充分洗涤(重复交替清洗3次),抽干,去除未反应的配基。
- 保存:制得的BSA亲和介质保存于4℃、20%乙醇溶液中。
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