Protein A亲和介质——层析介质优选西宝生物
Protein A能特异性地与抗体的Fc区结合,因此Protein A亲和介质可用于抗体(单抗和多抗)的分离纯化,经过一步亲和层析,即可从腹水、血清和培养液等样品中得到高纯度的抗体。西宝生物Protein A 亲和介质以高流速琼脂糖凝胶为基质,以重组Protein A为配基,具有优异的物理化学稳定性,配基不易脱落,寿命长,使用方便,应用广泛。
表1 Protein A QZT 4FF亲和介质的理化性质和产品特性
参数
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指标
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基质
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4%交联琼脂糖凝胶
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配基
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r-Protein A |
形状
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球形
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介质平均粒径
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90 μm (45-165)
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配基密度
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6 mg Protein A/mL wet gel |
动态载量
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45-50 mg h-IgG/mL wet gel |
最高流速(25℃)
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450 cm/h
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推荐流速
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<150 cm/h
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最高耐压
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0.3 MPa (3 bar) |
pH稳定性
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3-10(长时间);2-11(短时间)
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保存
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4-8 ℃(20%乙醇)
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- 平衡:用5-10CV的平衡缓冲液(20 mM PB+0.15 M NaCl,pH 7.0,添加适当浓度的NaCl抑制非特异性吸附)平衡层析柱,至流出液电导和pH不变(与平衡液一致)。
- 进料:样品缓冲液应尽可能与平衡液一致。固体样品可用平衡液溶解配制;低浓度样品溶液可用平衡液透析;高浓度样品溶液可用平衡液稀释。为了避免堵塞层析柱,样品应经离心或微滤(0.45 μm)处理。进料量根据介质的载量和料液中目标蛋白的含量计算。
- 淋洗:上样完毕后继续用平衡缓冲液淋洗至基线。
- 洗脱:用洗脱缓冲液(20 mM柠檬酸,pH 3.0;或0.1 M甘氨酸,pH 3.0;或20 mM乙酸钠,pH 3.0;具体洗脱条件与抗体的结合强度和稳定性密切相关,效果不好时应进行洗脱缓冲液(种类和pH或添加剂)的优化)洗脱,收集流出液。洗脱后,应立刻用碱性缓冲液(如1 M Tris/HCl, pH 9.0)将收集到的抗体溶液中和到抗体稳定的pH,避免抗体失活,维持抗体的生物活性。
- 再生、原位清洗:介质使用数次(5-10次,具体次数与原料的种类和来源及实验要求有关)后,需要对介质进行再生、在位清洗。
(2)也可用0.05 M NaOH+1 M NaCl或6 M盐酸胍淋洗柱子3-5 CV,并用3-10 CV的纯水冲洗,然后用缓冲液洗到中性即可重复使用。
其它注意事项:在装柱、使用和保存柱子的时候,要避免柱子流干,气泡进入。
- 载量分析:利用人免疫球蛋白(血浆来源,纯度95%,3 mg/mL)进行载量分析(柱体积2 ml;Buffer A:20 mM PB+0.15 M NaCl,pH 7.0,Buffer B:0.1 M甘氨酸,pH 3.0;流速:0.5 mL/min;上样量:40 mL),层析谱图如图1(A:进口介质;B:西宝介质)所示,结果表明两种介质的层析谱图(穿透行为、洗脱峰)基本一致,无明显差异。洗脱峰的蛋白浓度分析结果表明,二者的载量相当,均在40-45 mg h-IgG/mL介质之间。
- 纯化效果分析:利用小鼠腹水(Buffer A稀释4倍)上样进行亲和层析,考察介质的分离纯化效果(柱体积2 mL;Buffer A:20 mM PB+0.15 M NaCl,pH 7.0,Buffer B:20 mM柠檬酸,pH 3.0;流速:0.5 mL/min;上样量:4 mL),层析谱图如图2所示,纯度分析结果表明,经过一步亲和层析,即可得到纯度95%以上的IgG。
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